Oxydation anaérobie du propane couplée à la réduction des nitrates par une lignée de la classe Symbiobacteriia

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6115 (2022) Citer cet article

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On pense que les micro-organismes anaérobies jouent un rôle essentiel dans la régulation du flux d'alcanes gazeux à chaîne courte (SCGA, y compris l'éthane, le propane et le butane) des écosystèmes terrestres et aquatiques vers l'atmosphère. Il a été confirmé que le sulfate agit comme un accepteur d'électrons soutenant l'oxydation anaérobie microbienne des SCGA, mais plusieurs autres accepteurs énergétiquement plus favorables coexistent avec ces gaz dans des environnements anaérobies. Ici, nous montrons qu'un bioréacteur ensemencé avec de la biomasse provenant d'une installation de traitement des eaux usées peut effectuer une oxydation anaérobie du propane couplée à une réduction des nitrates en diazote gazeux et en ammonium. Le bioréacteur a fonctionné pendant plus de 1000 jours et nous avons utilisé des expériences de marquage au 13C et au 15N, des analyses métagénomiques, métatranscriptomiques, métaprotéomiques et métabolites pour caractériser la communauté microbienne et les processus métaboliques. Les données suggèrent collectivement qu'une espèce représentant un nouvel ordre au sein de la classe bactérienne Symbiobacteriia est responsable de l'oxydation du propane dépendante des nitrates observée. Le génome fermé de cet organisme, que nous désignons sous le nom de «Candidatus Alkanivorans nitratireducens», code les voies d'oxydation du propane en CO2 via l'ajout de fumarate et de réduction des nitrates, avec tous les gènes clés exprimés lors de l'oxydation du propane dépendante des nitrates. Nos résultats suggèrent que le nitrate est un puits d'électrons pertinent pour l'oxydation SCGA dans les environnements anaérobies, constituant un nouveau lien à médiation microbienne entre les cycles du carbone et de l'azote.

Une quantité considérable de gaz naturel est générée à partir des sédiments des grands fonds marins et des suintements d'hydrocarbures dans les marges continentales et les écosystèmes terrestres1,2. La majeure partie du gaz naturel libéré est consommée par les micro-organismes dans les zones anoxiques avant que le gaz ne se diffuse dans les environnements oxiques et l'atmosphère3,4,5. Les études sur l'oxydation anaérobie du gaz naturel se sont concentrées sur le puissant gaz à effet de serre, le méthane, en tant que composant le plus abondant (~ 60 à 90 %)6,7. Cependant, les alcanes gazeux à chaîne courte (SCGA), y compris l'éthane, le propane, le n-butane et l'isobutane, sont également des constituants importants du gaz naturel (jusqu'à ~20 %)8 et sont d'importants précurseurs de l'ozone et des aérosols organiques9. Les émissions atmosphériques globales des SCGA sont estimées à 9,2–9,6 Tg an−1 pour l'éthane, 9,6–10,5 Tg an−1 pour le propane, 10 Tg an−1 pour le butane et 4,2 Tg an−1 pour l'isobutane10.

L'oxydation anaérobie du méthane (AOM) a été largement étudiée et est relativement bien comprise7,11,12,13,14,15,16,17. Les archées anaérobies méthanotrophes (ANME) oxydent le méthane via la voie de méthanogenèse inverse, y compris le complexe clé méthyl-CoM réductase (MCR). L'ANME fait passer les électrons du méthane aux bactéries sulfato-réductrices syntrophiques (SRB)11,12 ou directement à la réduction des nitrates et des oxydes métalliques13,14,15,16. La bactérie 'Candidatus Methylomirabilis oxyfera' effectue l'OMA via la voie d'oxydation "intra-aérobie" du méthane en utilisant le nitrite comme seul accepteur d'électrons17. Les micro-organismes couplent probablement aussi l'oxydation des SCGA à la réduction de ces accepteurs d'électrons dans des conditions anoxiques18. 'Californie. M. oxyfera' s'est avéré capable d'oxyder l'éthane et le propane via la méthane monooxygénase, bien qu'il reste à démontrer si ces sources de carbone favorisent la croissance19. À ce jour, le sulfate a été le seul puits d'électrons identifié pour soutenir l'oxydation anaérobie des SCGA20,21,22,23,24,25. L'isolat deltaprotéobactérien Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxyde le propane et le butane via la voie d'addition de fumarate générant des succinates alkyl-substitués, un processus médié par l'alkylsuccinate synthase (ASS)20,21, et réduit directement le sulfate en sulfure. Il a été découvert qu'un enrichissement de l'archéon 'Candidatus Syntrophoarchaeum' activait le butane via la formation de butyl-coenzyme M, un processus catalysé par un MCR divergent, avec des équivalents réducteurs canalisés vers des partenaires SRB syntrophiques23. De même, l'oxydation anaérobie de l'éthane était liée au «Candidatus Argoarchaeum ethanivorans» apparenté, qui encodait également un complexe de type MCR et a été suggéré pour former une relation syntrophique avec SRB22. Cependant, un archéon capable de médier l'oxydation anaérobie du propane directement couplée à la réduction des sulfates n'a pas encore été identifié.

Comme le sulfate, le nitrate est un accepteur d'électrons courant dans les écosystèmes naturels26 et est utilisé par l'archéon 'Ca de l'ANME. Methanoperedens nitroreducens' pour l'OMA13. La réduction des nitrates couplée à l'oxydation des SCGA (Eq. (1), en utilisant le propane comme exemple) est également plus réalisable sur le plan thermodynamique que les réactions d'oxydation des SCGA couplées à la réduction des sulfates (△Go' = -102 kJ/mol propane)20, mais n'est encore liée à aucune lignée microbienne.

Ici, nous avons combiné des tests de masse et d'équilibre électronique, des expériences de marquage 13C et 15N, le séquençage d'amplicon du gène ARNr 16S, des analyses de métabolites et des approches multi-omiques pour fournir la preuve qu'une nouvelle espèce bactérienne au sein de la classe Symbiobacteriia effectue une oxydation anaérobie du propane couplée à la réduction des nitrates.

Dans cette étude, un bioréacteur anaérobie ensemencé avec de la biomasse provenant d'une installation de traitement des eaux usées a été alimenté par impulsions avec du propane et du nitrate pendant plus de 1000 jours. Les données de performance à long terme ont montré une consommation simultanée de propane et de nitrate, avec une accumulation d'ammonium, de diazote gazeux et une accumulation transitoire de nitrite (Fig. 1 supplémentaire). Aucune consommation de nitrate n'a été observée dans les incubations témoins (sans l'ajout de biomasse de culture d'enrichissement ou de propane, Fig. 2 supplémentaire), ce qui suggère que la réduction des nitrates (en nitrite, ammonium et N2) couplée à la consommation de propane dans le bioréacteur était à médiation microbienne. Pour confirmer la réaction d'oxydation anaérobie du propane dépendante du nitrate et pour vérifier les produits finaux de celle-ci, la biomasse du réacteur parent a été incubée dans des expériences discontinues avec du propane marqué au 13C (13CH313CH213CH3) et du nitrate marqué au 15N (15NO3-) ajoutés à ~ 8% et ~ 1% du propane total et du nitrate total, respectivement. La quantité de CO2 total et de CO2 marqué au 13C a augmenté, accompagnée d'une diminution de C3H8 et 13C3H8 (Fig. 1a, b). Le rapport (2,42) entre le 13CO2 total produit (46 μmol) et le 13C3H8 total consommé (19 μmol) était proche du rapport stoechiométrique théorique de 3:1. Le bilan carbone suggère que le propane a été oxydé avec du CO2 comme produit final. La consommation totale de NO3− (0,73 mmol) était cohérente avec la production totale combinée de N2 et de NH4+ (0,8 mmol) (Fig. 1c). De même, la consommation de 15NO3− (9,38 μmol) était proche du 15N dans 29N2 (1,1–1,5% du N2 total), 30N2 (0,03% du N2 total) et 15NH4+ produit, qui s'élevait à 9,71 μmol en combinaison (Fig. 1d). Ces résultats ont confirmé la réduction du nitrate en diazote gazeux et en ammonium. Les électrons générés par l'oxydation anaérobie du propane (AOP, 5,03 mmol) étaient proches de la demande d'électrons pour la réduction de NO3− en N2 et NH4+ (5,15 mmol), ce qui suggère que les électrons générés par l'AOP ont été utilisés pour la dénitrification et la réduction dissimilatoire des nitrates en ammoniac (DNRA), conformément aux réactions suivantes27 :

a Conversion de C3H8 en CO2, b 13C3H8 en 13CO2, c NO3− en NH4+ et N2 avec formation transitoire de NO2−, d 15NO3− en 15NH4+ et 29N2 avec formation transitoire de 15NO2−. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Des expériences stoechiométriques ont été menées à la fois dans le réacteur parent et dans des incubations discontinues ensemencées avec de la biomasse du système parent, pour établir plus précisément les bilans d'azote et d'électrons. La réduction des nitrates / nitrites semble se produire en deux étapes distinctes (Fig. 2a). À l'étape 1 (avant l'épuisement des nitrates), le nitrate a été converti en nitrite et diazote gazeux avec une production d'ammonium négligeable. À l'étape 2 (après l'épuisement des nitrates), du diazote gazeux et de l'ammonium ont été générés à partir du nitrite accumulé à l'étape 1. L'observation selon laquelle la DNRA se produisait principalement lorsque le nitrate devenait limitant est cohérente avec les études précédentes28,29,30. Le rapport entre la consommation de nitrate et le diazote gazeux et la production d'ammonium dans les tests par lots en triple (Fig. 2a, Supplémentaire Fig. 3) était de 1,03 ± 0,05 (Fig. 2b, Supplémentaire Tableau 1), ce qui suggère que le nitrate a finalement été entièrement converti en diazote gazeux (57,3 ± 5,5 %) et en ammonium (42,7 ± 5,5 %). Le rapport entre la production d'électrons (calculée à partir de l'oxydation du propane en CO2) et la consommation d'électrons (réduction des nitrates) était de 1,10 ± 0,01 (Fig. 2b, tableau supplémentaire 1), ce qui suggère que la réduction des nitrates était le principal puits d'électrons pour l'oxydation du propane.

a Profil biochimique typique des systèmes (commencé le jour 1050) montrant une consommation simultanée de nitrate et de propane avec formation transitoire de nitrite et production de diazote gazeux et d'ammonium. La réduction des nitrates semble se produire en deux phases distinctes. À l'étape 1, le nitrate a été converti en nitrite et diazote gazeux avec une production d'ammonium négligeable; tandis qu'à l'étape 2, du diazote gazeux et de l'ammonium ont été générés à partir du nitrite accumulé. b Les bilans moyens d'azote et d'électrons ont été calculés à partir des trois tests par lots (pour les données complètes et le calcul, voir le tableau supplémentaire 1). Les barres d'erreur représentent les erreurs standard. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le profilage communautaire avec séquençage de l'amplicon du gène ARNr 16S a révélé qu'un phylotype bactérien appartenant à une lignée non classée au sein du phylum Firmicutes était la population la plus abondante dans le bioréacteur (20, 1% au jour 985, Fig. 4 supplémentaire), bien qu'il soit indétectable dans l'inoculum. Pour obtenir un génome représentatif de la population dominante, un séquençage métagénomique à lecture longue (Nanopore) et à lecture courte (Illumina) (Données supplémentaires 1) a été réalisé sur la biomasse du bioréacteur échantillonné le jour 1040. 11 génomes circularisés complets (Données supplémentaires 1). La population la plus abondante a été classée dans la base de données de taxonomie du génome (GTDB) pour représenter un nouvel ordre au sein de la classe Symbiobacteriia du Phylum Firmicutes (22,8 % d'abondance relative, tableau supplémentaire 2). Nous proposons le nom «Candidatus Alkanivorans nitratireducens» pour cette bactérie en raison de sa capacité de dégradation du propane dépendante des nitrates (voir ci-dessous). Le gène de l'ARNr 16S (1536 pb) récupéré du 'Ca. Le MAG d'A. nitratireducens était identique à l'abondante séquence d'amplicon du gène de l'ARNr 16S affiliée aux Firmicutes. La CA. Le MAG d'A. nitratireducens était complet et circularisé avec une taille de 2, 43 Mbp (Fig. 6 supplémentaire). Un arbre phylogénétique basé sur le génome a montré que le 'Ca. A. nitratireducens' était phylogénétiquement distinct des Symbiobacteriia accessibles au public (Fig. 3a). L'identité moyenne des nucléotides (ANI) et l'identité des acides aminés (AAI) de 'Ca. Le génome d'A. nitratireducens, comparé à ceux de ses plus proches parents dans GTDB, à savoir Symbiobacteriia ZC4RG38, Symbiobacterium sp003242675 et Symbiobacterium thermophilum (<75,0% et 53,8–55,2% pour ANI et AAI, respectivement), soutient la classification de 'Ca. A. nitratireducens' en tant que nouvel ordre au sein de la classe Symbiobacteriia31. L'arbre génétique de l'ARNr 16S (Fig. 7 supplémentaire) révèle également que le 'Ca. A. nitratireducens' est phylogénétiquement éloigné des autres Symbiobacteriia classées (<84,1 % d'identité du gène de l'ARNr 16S)31 et n'a pas de parents proches dans la base de données Silva. Trois sondes FISH (SYMB-1018, SYMB-624 et SYMB-186) ont été conçues et appliquées individuellement à la biomasse du bioréacteur pour visualiser la morphologie et l'arrangement spatial du 'Ca. Cellules d'A. nitratireducens. L'examen microscopique de la biomasse a révélé des flocs diffus avec les cellules semblant être noyées dans une matrice de type substance polymère extracellulaire. 'Californie. A. nitratireducens' apparaissait sous la forme de cellules en forme de bâtonnet incrustées (~ 0, 5 µm × 1, 5 µm) qui formaient parfois des agrégats (jusqu'à ~ 50 µm) et étaient abondantes et relativement uniformément dispersées dans les flocs (Fig. 3b et Supplémentaire Fig. 8). La morphologie et la disposition spatiale des cellules étaient cohérentes pour les trois sondes, ce qui donne confiance dans leur spécificité (Fig. 8 supplémentaire).

un arbre phylogénétique basé sur le génome. La CA. Le génome d'A. nitratireducens de cette étude est surligné en rouge. Les points noirs et blancs représentent respectivement > 90 % et > 70 % des valeurs bootstrap. Les barres d'échelle indiquent les substitutions d'acides aminés par site. b Une micrographie de fluorescence composite de la culture d'enrichissement hybridée avec la sonde FISH SYMB-1018 (Cy3, rouge ; ciblant « Ca. A. nitratireducens ») et colorée au DAPI (bleu ; toutes les cellules microbiennes). 'Californie. Les cellules d'A. nitratireducens apparaissent en magenta (bleu + rouge). La barre d'échelle indique 20 μm. L'image représentative a été sélectionnée sur la base de l'évaluation visuelle de six expériences d'hybridation distinctes. Des résultats cohérents ont également été obtenus indépendamment avec deux sondes supplémentaires ciblant le 'Ca. Population d'A. nitratireducens (Fig. 8 supplémentaire). c, d Expression relative de chaque génome et contigs non binés, et métabolisme microbien d'intérêt pour les génomes dans le bioréacteur. Le total des transcrits par million (TPM) a été calculé pour chaque gène. Les ensembles de génomes avec une expression globale du TPM total > 1 % sont présentés (c). L'annotation KEGG a été utilisée pour identifier les ORF codant pour la dénitrification (M00529) et la réduction dissimilatoire du nitrate en ammonium (M00530) (d). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Annotation du 'Ca. Le MAG d'A. nitratireducens a identifié des gènes pour un complexe ASS comprenant deux AssD (séquences d'acides aminés identiques) et trois sous-unités AssA (89,3 à 90,7% de similitudes dans les séquences d'acides aminés, Fig. 9 supplémentaire), qui interviennent dans la première étape de l'activation anaérobie des SCGA via l'ajout de fumarate20,32. Alignement de 'Ca. Les séquences d'acides aminés AssA d'A. nitratireducens avec des séquences homologues dans la base de données NCBI ont confirmé la conservation des résidus d'acides aminés clés (Gly828 et Cys489 dans AssA1, Gly501 et Cys169 dans AssA2, Gly828 et Cys489 dans AssA3, Fig. 10 supplémentaire), qui sont importants pour la fonction des enzymes d'ajout de fumarate33. Les analyses phylogénétiques ont révélé que l'AssA et l'AssD de 'Ca. A. nitratireducens' sont phylogénétiquement éloignés des enzymes d'addition de fumarate (AssAD et BssAD) dans les bases de données NCBI et UniRef (Fig. 4c; Fig. Supplémentaire 11). De plus, le 'Ca. Le MAG d'A. nitratireducens abrite tous les gènes nécessaires à la poursuite de la dégradation du propylsuccinate/iso-propylsuccinate, y compris les gènes de la méthylmalonyl-CoA mutase (mcmA) pour le réarrangement du squelette carboné, les gènes de la propionyl-CoA carboxylase (pccB) pour la décarboxylation et les gènes clés de la bêta-oxydation34,35 (Fig. 5; Données supplémentaires 2). L'acétyl-CoA généré par la bêta-oxydation peut entrer dans le cycle de l'acide tricarboxylique oxydatif (TCA) pour une oxydation complète en CO2 ou pour la régénération du fumarate pour les cycles ultérieurs d'activation du propane (Fig. 5). L'isobutyryl-CoA pourrait être oxydé, via le semialdéhyde méthylmalonique, en propionyl-CoA36, qui pourrait être utilisé pour régénérer le fumarate via la voie méthylmalonyl-CoA (Fig. 5). Les gènes de la CO déshydrogénase: acétyl-CoA synthase (CODH / ACS) et de la voie inverse Wood – Ljungdahl (WL) ont été identifiés dans 'Ca. A. nitratireducens', suggérant que l'oxydation terminale de l'acétyl-CoA en CO2 peut être médiée par CODH/ACS et la déshydrogénation par étapes des unités C1 dérivées37,38 (Fig. 5 ; Données supplémentaires 2 ; Tableau supplémentaire 3). Cette voie WL pour la production de CO2 est cohérente avec celle proposée pour le Desulfosarcina aeriophaga BuS521 dégradant le propane dépendant du sulfate. Actuellement, la classe des symbiobactéries ne comprend que 3 génomes dans la base de données GTDB et aucun modèle métabolique n'est disponible pour les métabolismes anaérobies du propane. Par conséquent, d'autres études sont nécessaires pour construire des modèles métaboliques pour 'Ca. A. nitratireducens' afin de calculer les flux de carbone pour les voies TCA et WL et de comprendre comment les cellules régulent ces deux voies.

a Les chromatogrammes ioniques partiels (transition ionique, m/z : 289 > 147,2) des extraits de culture enrichis (n = 3, pris à différents moments) ont révélé un pic au temps de rétention de 10,832 min, correspondant au pic de l'iso-propylsuccinate standard. b Un pic au temps de rétention de 11,078 min (transition ionique, m/z : 289 > 147,1), correspondant au pic de l'étalon de succinate de propyle, a été observé pour les extraits cellulaires de la culture enrichie (n = 3 à différents points de prélèvement). c Relation phylogénétique de 'Ca. A. nitratireducens' AssA (rouge) à d'autres AssA et BssA dans la base de données NCBI. Trois sous-unités AssA (AssA123) trouvées dans 'Ca. Le MAG d'A. nitratireducens a formé un groupe séparé. Les valeurs bootstrap > 90 % sont affichées sous forme de points noirs sur les nœuds de branche. La barre d'échelle représente les substitutions d'acides aminés par site.

La CA. La culture d'enrichissement d'A. nitratireducens a utilisé une alkylsuccinate synthase pour activer le propane en n- et iso-propylsuccinate. L'acétyl-CoA est produit après réarrangement du squelette carboné, décarboxylation et bêta-oxydation. L'oxydation de l'acétyl-CoA en CO2 est catalysée par des enzymes impliquées dans le cycle oxydatif de l'acide tricarboxylique ou la voie inverse Wood-Ljungdahl (étiquettes violettes). 'Californie. A. nitratireducens' abritait toutes les enzymes impliquées dans la dénitrification (NapAB, NorB, NosZ, sauf NirS/K) et les processus DNRA (NapAB, NrfAH) (texte en vert). Expression génique normalisée pour 'Ca. A. nitratireducens' est indiqué par TPM (transcrits totaux par million). L'augmentation de l'épaisseur de la ligne montre l'augmentation des valeurs d'expression génique. Les enzymes étiquetées en bleu, vert, violet et gras ont été entièrement ou partiellement identifiées dans les extraits protéiques, tandis que le texte rouge indique que les enzymes n'ont pas été détectées. Alkylsuccinate synthase, Ass; Acyl-CoA synthétase à longue chaîne, FadD ; Méthylmalonyl-CoA mutase, Mcm; Propionyl-CoA carboxylase, Pcc; Succinate-CoA ligase, Suc; succinate déshydrogénase, Sdh; Acide tricarboxylique, TCA ; CO déshydrogénase : acétyl-CoA synthase, CODH/ACS ; Méthylènetétrahydrofolate déshydrogénase, Mthfd ; méthylènetétrahydrofolate réductase, Mthfr; Formyltétrahydrofolate déformylase, Fthd; formiate déshydrogénase, Fdh; ATPase de transport H+ de type F, ATP ; NADH-quinone oxydoréductase, Nuo; Antiporteur multicomposant Na+ H+, Mnh ; Ménaquinol, MKH2 ; Ménaquinone, MK ; Nitrate réductase, Nap ; Cytochrome c 552 nitrite réductase, Nrf; Oxyde nitrique réductase, Nor; Protoxyde d'azote réductase, Nos.

Les analyses métatranscriptomiques et métaprotéomiques ont révélé que les gènes impliqués dans les voies proposées pour l'oxydation anaérobie complète du propane en CO2 étaient fortement exprimés dans 'Ca. A. nitratireducens' et leurs produits géniques correspondants ont également été détectés dans des extraits protéiques après addition de propane (avec la formyltétrahydrofolate déformylase et la formiate déshydrogénase comme exceptions, Fig. 5 ; Données supplémentaires 2), indiquant que 'Ca. A. nitratireducens' a joué un rôle actif dans l'AOP au cours des étapes 1 et 2. Une recherche dans l'ensemble de la bibliothèque de métagénomes n'a suggéré aucune autre population dans le système encodant des gènes connus liés à l'AOP, y compris les gènes de l'ASS20,32 et de l'alkyl-coenzyme M réductase22,23. L'activité relative des populations microbiennes coexistantes (représentant collectivement 14 à 22% des lectures totales du transcriptome) était également nettement inférieure à celle de 'Ca. A. nitratireducens '(64–83% des lectures totales du transcriptome, Fig. 3c). Ces résultats suggèrent fortement que 'Ca. A. nitratireducens' était responsable de l'AOP dans le système.

Des extraits cellulaires de la biomasse d'enrichissement ont été analysés pour les métabolites clés de la voie d'activation à l'aide de la spectrométrie de masse triple quadripôle ultra-haute sensibilité. Les chromatogrammes d'ions totaux indiquaient un temps de rétention identique pour les étalons de propylsuccinate et les métabolites extraits (Fig. 12 supplémentaire). Des pics de masse correspondant aux normes iso-propylsuccinate (m/z : 289 > 147,2) et propylsuccinate (m/z : 289 > 147,1) ont été détectés dans les extraits cellulaires (Fig. 4a, b). Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle 'Ca. A. nitratireducens 'active le propane par clivage homolytique de la liaison CH au niveau des atomes de carbone primaires et secondaires, et avec l'ajout de fumarate, donne du propylsuccinate et de l'isopropylsuccinate. De plus, l'iso-propylsuccinate (5, 96 nM) était plus abondant que le propylsuccinate (2, 33 nM) dans les extraits de culture, ce qui suggère que l'activation secondaire de l'atome de carbone générant l'iso-propylsuccinate est la principale voie d'oxydation du propane (Fig. 5).

La CA. Le MAG d'A. nitratireducens contient également tous les gènes nécessaires au DNRA (Fig. 5; Tableau supplémentaire 4), y compris une nitrate réductase (napAB) qui catalyse la réduction du nitrate en nitrite, et les nitrites réductases du cytochrome c (nrfAH) responsables de la réduction du nitrite généré en ammonium. Les résultats métatranscriptomiques ont révélé que les gènes napAB codés par 'Ca. A. nitratireducens' étaient plus fortement exprimés au stade 1 par rapport au stade 2, ce qui correspond à la concentration plus élevée de nitrate au stade 1 (Fig. 13a supplémentaire). De plus, 'Ca. La nrfAH d'A. nitratireducens était fortement exprimée au stade 2, où la majeure partie de l'ammonium était générée (Fig. 13b supplémentaire). De plus, les sous-unités catalytiques de la nitrate réductase (NapAB) et de la nitrite réductase du cytochrome c (NrfA) ont également été identifiées dans des extraits protéiques (Fig. 5; Tableau supplémentaire 4). D'autres membres de la communauté ont également exprimé des gènes pour les voies de réduction dissimilatoires des nitrates (dénitrification et DNRA; Fig. 3d), mais à des niveaux nettement inférieurs à ceux de 'Ca. A. nitratireducens'.

La contribution de 'Ca. A. nitratireducens 'à la production observée de diazote gazeux n'est pas complètement claire étant donné que le MAG représentatif fermé manque d'une nitrite réductase productrice d'oxyde nitrique identifiable (nirS / K). Le MAG a le potentiel annoté pour les deux dernières étapes de dénitrification ; codant pour l'oxyde nitrique réductase (norB) et l'oxyde nitreux réductase (nosZD) pour la conversion de l'oxyde nitrique en diazote gazeux (Fig. 5; Tableau supplémentaire 4). Ces gènes étaient fortement exprimés dans les deux étapes et ont été détectés dans les extraits protéiques (tableau supplémentaire 4), indiquant que ce micro-organisme contribue à la réduction de l'oxyde nitrique en diazote gazeux. Ces observations suggèrent que 'Ca. A. nitratireducens' peut utiliser un nouveau gène ou une nouvelle voie pour la réduction des nitrites en oxyde nitrique. En effet, plusieurs autres microbes, tels que Bacillus vireti et les bactéries méthylotrophes, ont été signalés comme produisant de l'oxyde nitrique même s'ils n'hébergent pas les gènes nirS/K39,40,41. Il est également possible que d'autres membres de la communauté contribuent à la dénitrification observée en diazote gazeux, ou à la réduction des nitrites en oxyde nitrique. Cependant, l'expression des gènes nirS/K et d'autres gènes de dénitrification était relativement faible pour toutes les autres populations (Fig. 3d), ce qui suggère que 'Ca. A. nitratireducens' était responsable de la majeure partie des transformations de l'azote et du carbone dans le système.

L'identification d'une firmicute anaérobie oxydant le propane élargit la diversité phylogénétique connue des lignées microbiennes qui interviennent dans l'oxydation anaérobie des SCGA dans l'environnement, déjà démontrée pour les membres de la Deltaproteobacteria et du phylum archéen Halobacteriota. À notre connaissance, cette étude est la première à identifier un microorganisme médiant l'oxydation anaérobie du propane dépendante des nitrates (n-DAPO). Compte tenu de la prévalence du nitrate dans divers écosystèmes naturels et artificiels, combinée à l'augmentation des émissions atmosphériques de propane due à la production de pétrole et de gaz naturel42, le processus n-DAPO précédemment non décrit se produit probablement dans les environnements naturels, représentant un lien négligé entre le cycle mondial du carbone et de l'azote. Le procédé n-DAPO récemment découvert pourrait jouer un rôle important dans la réduction de l'impact négatif du propane sur la qualité de l'air et sur le climat, ce qui justifie des recherches plus approfondies. Bien que le propane soit un gaz à effet de serre moins puissant que le méthane, il peut réagir avec le radical hydroxyle, entraînant une production accrue d'ozone9,43. De plus, le propane contribue à la formation de NO2 et de nitrate de peroxyacétyle, deux polluants atmosphériques importants43. L'identification et la caractérisation de 'Ca. A. nitratireducens' contribue à une meilleure compréhension du rôle des micro-organismes dans la régulation des émissions SCGA.

Alkanivorans (al.ka.ni.vo'rans. NL neut. n. alkanum, alcane ; L. pres. part. vorans, dévorant ; NL masc. n. Alkanivorans, un mangeur d'alcane). nitratireducens (ni.tra.ti.re.du'cens. NL masc. n. nitras (gén. nitratis), nitrate ; L. pres. part. reducens, conversion en un état différent ; NL part. adj. nitratireducens, réducteur nitrate). Ce nom implique un organisme capable de consommer du propane et de réduire les composés azotés.

Enrichi à partir d'un mélange de boues de digestion anaérobie et de boues activées provenant d'une station d'épuration à Brisbane, Australie.

Bactéries anaérobies, oxydant le propane et réduisant les nitrates, généralement observées sous forme de cellules en forme de bacille d'environ 0,5 (diamètre) × 1,5 µm (longueur), formant parfois des grappes. Mésophile en termes de température et de pH (enrichi à 22–25 °C et pH 7–8).

Sans un accès facile aux sédiments dans un environnement riche en propane, comme les suintements de gaz en haute mer ou les sédiments de sources chaudes, un mélange d'environ 100 ml de boues de digestion anaérobie et 50 ml de boues activées d'une usine de traitement des eaux usées à grande échelle (Brisbane, Australie) a été utilisé comme inoculum pour l'enrichissement du bioréacteur. Les eaux usées contiennent généralement une large gamme de substrats organiques permettant la croissance d'une gamme variée de micro-organismes. De plus, de petites quantités de propane pourraient également être générées dans les systèmes de digestion anaérobie44. Nous avons émis l'hypothèse que certains micro-organismes oxydant le propane pourraient être présents dans de tels systèmes. L'inoculum a été incubé dans un bioréacteur de 2,3 L avec 1,84 L de milieu synthétique anoxique préparé comme décrit précédemment45, laissant un espace de tête de 0,46 L. La pression partielle de propane dans l'espace de tête a été maintenue entre 0,9 et 1,4 atm en rinçant périodiquement le liquide et l'espace de tête avec du gaz propane pur (99,99 %, Coregas, Australie). L'hélium a été injecté manuellement dans l'espace de tête pour pressuriser le réacteur jusqu'à 1,5 atm. Le nitrate a été introduit par impulsions dans le réacteur par injection manuelle d'une solution mère concentrée (80 g NO3--N l-1). Le bioréacteur a été mélangé en continu avec un agitateur magnétique (IKA, Labtek, Australie) à 400 tr/min et incubé à température ambiante (22 ± 2 °C). Le pH a été contrôlé entre 7 et 7,5 en ajoutant manuellement une solution de HCl anoxique 1 M. Tous les 1 à 3 mois, 200 ml de surnageant ont été échangés avec du milieu synthétique frais. Un échantillon liquide (un ml) a été prélevé 2 à 3 fois par semaine via le port d'échantillonnage du bioréacteur et filtré à 0, 22 μm (filtre en polyéthersulfone, Millex, États-Unis) pour la mesure du nitrate, du nitrite et de l'ammonium. Un échantillon de gaz (100 μL) a été prélevé dans l'espace de tête à l'aide d'une seringue étanche aux gaz (Hamilton, États-Unis) 2 à 3 fois par semaine pour la mesure du propane et du diazote gazeux.

Pour la détermination stoechiométrique de la réduction des nitrates et de l'oxydation anaérobie du propane, les concentrations de propane et d'azote dans l'espace de tête du bioréacteur de 2,3 L ont été périodiquement mesurées en plus du nitrate, du nitrite et de l'ammonium du jour 990 au jour 1000. De plus, deux tests par lots ont également été effectués dans des récipients en verre de 650 mL avec un sous-échantillon de 500 mL de biomasse transféré de manière anaérobie du bioréacteur de 2,3 L (tableau supplémentaire 5). La biomasse a ensuite été purgée avec du gaz argon (99,99 %, Coregas, Australie) pendant 20 min pour éliminer le propane dissous dans le liquide. Environ 45 ml de gaz propane ont été ajoutés à l'espace de tête en tant que seul donneur d'électrons. Des cultures enrichies sans propane et un milieu synthétique stérile avec du propane ont été mis en place comme témoins (tableau supplémentaire 5). Chaque test de lot a été réalisé en triple exemplaire.

Pour les expériences de marquage isotopique, un sous-échantillon de 500 ml de biomasse du bioréacteur a été transféré de manière anaérobie dans un récipient en verre de 650 ml. La biomasse a été purgée avec du gaz propane pur (99,99 %, Coregas, Australie) pendant 20 min. Environ 12 ml de propane marqué au 13C (13CH313CH213CH3, 99 % atomique de 13C, Sigma) ont été injectés dans l'espace de tête à travers le septum. Environ 1 ml de solution mère de nitrate (10 g NL-1) contenant environ 1 % de nitrate de sodium marqué au 15N (98 % atomique 15N, Sigma) a été ajouté pour atteindre une concentration d'environ 20 mg NL-1. À l'aide d'une seringue étanche aux gaz, des échantillons de gaz ont été prélevés périodiquement dans l'espace de tête (Hamilton, États-Unis), puis injectés dans des flacons rincés à l'hélium (Exetainer, Royaume-Uni). Des échantillons liquides ont été prélevés, filtrés (0,22 μm) et stockés à -20 ° C jusqu'à l'analyse de 15NO3-, 15NO2- et 15NH4+. Pour quantifier le CO2 produit dans la phase liquide, des échantillons non filtrés ont été injectés dans des flacons Exetainer, acidifiés avec une solution de HCl 1 M et équilibrés avec l'espace de tête pendant au moins 0,5 h avant la détermination du CO2.

Les concentrations de nitrate, de nitrite et d'ammonium dans les échantillons filtrés ont été déterminées à l'aide d'un analyseur d'injection de flux Lachat QuickChem8000 (Lachat Instrument, Milwaukee, WI). Les concentrations de propane, d'azote et de dioxyde de carbone dans l'espace de tête ont été quantifiées avec un chromatographe en phase gazeuse (GC, 7890 A, Agilent, USA) équipé d'un détecteur de conductivité thermique et d'une colonne garnie Shincarbon ST (2 m × 2,0 mm). Le chromatographe en phase gazeuse a été opéré en utilisant de l'argon comme gaz porteur (débit, 28 mL min-1). Les températures du four, de l'injecteur et du détecteur ont été maintenues à 220, 250 et 260 °C, respectivement. Les concentrations de propane, d'azote et de dioxyde de carbone ont été calculées sur la base d'une courbe d'étalonnage externe.

Les échantillons marqués isotopiquement contenant du nitrate et du nitrite ont été divisés en deux sous-échantillons égaux. Pour un sous-échantillon, les fractions de nitrate et de nitrite 15N ont été mesurées avec un spectromètre de masse à rapport isotopique Thermo Delta V (IRMS) après conversion en N2O46. Pour l'autre sous-échantillon, le nitrite a été éliminé à l'aide d'acide sulfamique à 4 % (poids/volume) dans du HCl47 à 10 %, et la fraction 15N dans le nitrate restant a été mesurée par IRMS. La fraction de 15N dans les nitrites a ensuite été calculée à l'aide de l'équation : fractions de 15N dans (NO3− + NO2−) × quantité totale de (NO3− + NO2−) = fraction de 15N dans NO3− × quantité totale de NO3− + fraction de 15N dans NO2− × quantité totale de NO2−. À l'aide d'une méthode de microdiffusion48,49, l'ammonium a été piégé dans des filtres GF/D (Whatman, Royaume-Uni) qui ont ensuite été brûlés pour une analyse isotopique à l'aide de l'IRMS. Le 29N2, le 30N2, le propane marqué au 13C et le 13CO2 dans les échantillons de gaz ont été déterminés avec un chromatographe en phase gazeuse (7890 A, Agilent, États-Unis) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire (5957 C inert MSD, Agilent, États-Unis). Le chromatographe en phase gazeuse était équipé d'une colonne J&W HP-PLOT Q PT (30 m × 530 μm) et fonctionnait avec de l'hélium comme gaz vecteur (débit 5,58 mL/min). Le four a été maintenu à 45°C pendant 2 min, puis chauffé à une vitesse de 10°C/min à 60°C où il a été maintenu pendant 6 min. N2, CO2 et C3H8 ont été détectés à un impact électronique de 70 eV (EI) en utilisant la procédure d'autoréglage standard pour l'étalonnage de masse. L'acquisition a été réalisée en chromatographie ionique totale (TIC) pour l'identification et en surveillance d'ions sélectionnés (SIM) pour la surveillance des signaux m/z à 28, 29 et 30 Da (N2), 44 et 45 Da (CO2), 44 et 47 Da (C3H8) avec un temps de séjour de 100 ms pour chaque signal. Le traitement des données a été réalisé à l'aide du programme Chemstation (Agilent, États-Unis).

Des échantillons de biomasse (10 ml) ont été prélevés du bioréacteur d'enrichissement tous les 2 à 3 mois et granulés par centrifugation (8 000 × g pendant 10 min) pour l'extraction de l'ADN. L'ADN a été extrait à l'aide du kit FastDNA SPIN for Soil (MP Biomedicals, USA) selon le protocole du fabricant. Les concentrations d'ADN ont été mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). Le séquençage des amplicons pour les gènes d'ARNr 16 S (régions V6 à V8) a été réalisé à l'aide du jeu d'amorces universel 926 F (5ʹ-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3ʹ) et 1392 R (5ʹ-ACGGGCGGTGTGTRC-3ʹ)50 sur une plateforme Illumina MiSeq (Illumina, États-Unis) à l'Australian Center for Ecogenomics (ACE; Brisbane, Australie). Les résultats de séquençage ont été traités à l'aide de QIIME250.

L'ADN extrait au jour 1040 (pour le métagénome initial) et au jour 1100 (pour le métagénome peu profond) a été séquencé via des bibliothèques appariées à lecture courte à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèque d'ADN Illumina Nextera XT et de la plateforme NextSeq500 (Illumina, États-Unis) chez ACE, sur la base du protocole du fabricant. Des échantillons pour le séquençage métagénomique superficiel ont également été prélevés en même temps que des échantillons pour le séquençage métatranscriptomique afin de s'assurer que la communauté microbienne était cohérente avec le métagénome initial (Fig. 14 supplémentaire). Les bibliothèques ont généré respectivement 149 millions et 1 million de lectures pour le métagénome initial et superficiel (Données supplémentaires 1). Les doublons, les adaptateurs et les bases de mauvaise qualité dans les lectures générées ont été supprimés à l'aide de ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) avec le paramètre "–remove_dups–minlen 100" qui appelle en interne FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), FastUniq-1.151, cutadapt 2.10 et Trimmomatic-0.3652.

La biomasse du réacteur discontinu (jour 1120) a également été soumise à un séquençage à lecture longue Nanopore. L'ADN a été extrait à l'aide du kit Qiagen PowerSoil Pro (Qiagen, Allemagne) et la qualité a été vérifiée à l'aide d'une combinaison du kit de dosage Qubit 1x dsDNA HS sur le fluoromètre Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) et du kit QIAxcel DNA High Resolution sur le système QIAxcel Advanced (Qiagen, Allemagne). La préparation de la bibliothèque a été réalisée selon le protocole du fabricant et séquencée sur un PromethION (Oxford Nanopore Technologies, USA). L'appel de base a été effectué à l'aide d'Albacore (https://github.com/Albacore/albacore), ce qui a donné 73 millions de lectures avec une qualité > Q5. Parmi eux, 12 millions de lectures étaient supérieures à 1 000 pb avec une lecture N50 de 6 135 pb. Les adaptateurs ont été coupés à l'aide de Porecho v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop).

Aviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) a été utilisé pour l'assemblage hybride et le binning de lectures courtes et longues, appelant en interne plusieurs assembleurs et outils de binning différents. Les résultats ont été vérifiés manuellement à l'aide de Bandage53. Les bacs résultants ont été organisés à l'aide de DASTools 1.1.254. Les génomes récupérés ont ensuite été dérépliqués à l'aide du flux de travail «dérépliqué» dans drep-3.2.255 avec les paramètres par défaut, ce qui a donné un ensemble de génomes non redondants composé de 59 génomes de haute qualité. La couverture des informations sur le génome et d'autres détails a été visualisée et vérifiée manuellement à l'aide de l'IGV 2.11.156. L'exhaustivité et la contamination des génomes ont été vérifiées à l'aide de CheckM v1.1.357. Les lectures courtes de qualité ont été mappées sur l'ensemble MAG final et les contigs non regroupés à l'aide du nœud papillon 2.3.4.3. Les mappages avec un rapport de longueur aligné sur une lecture <75 % ou une identité de région alignée <97 % ont été supprimés. L'abondance de chaque MAG a été profilée à l'aide de CoverM 0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) avec uniquement des mappages primaires de qualité. NGA50 et d'autres caractéristiques du génome ont été calculées à l'aide du package Python BioSut (https://github.com/jlli6t/BioSut).

Pour tous les MAG et les contigs non groupés, des cadres de lecture ouverts (ORF) ont été appelés et l'annotation primaire des génomes a été effectuée à l'aide de Prokka 1.14.558 avec le domaine déduit de la classification GTDB-Tk. La base de données KEGG Orthology HMM (consultée en juillet 2021) a été recherchée à l'aide de kofamscan 1.3.059, en sélectionnant le meilleur résultat pour chaque gène avec une valeur e <1e-10 et une mesure F maximale. UniRef10060 (consulté en mars 2020) a été indexé avec la base de données de taxonomie NCBI et recherché à l'aide de diamond61 v2.0.11.149 avec 'blastp–sensible'. Le top hit avec la valeur e <1e-5 et l'identité > 30 a été sélectionné et mappé à la base de données KEGG Orthology. La base de données eggNOG v5 a été recherchée à l'aide d'emapper 2.1.5 en mode diamant. Le ou les motifs conservés présents dans les gènes prédits liés à l'oxydation du propane et au métabolisme de l'azote ont été vérifiés plus avant à l'aide de la recherche de domaine conservé du NCBI62. Les numéros KO annotés ont été utilisés pour déduire la voie codée dans chaque génome. Les voies ont été identifiées comme « non exprimées » si les blocs manqués > 75 % lorsque le nombre total de blocs > 5, ou les blocs manqués > 1 lorsque le nombre total de blocs ≤ 5.

Un arbre du génome bactérien a été construit à l'aide de la base de données de taxonomie du génome (GTDB r202) et a récupéré des génomes bactériens avec un ensemble concaténé de 120 gènes marqueurs conservés spécifiques aux bactéries déduits des génomes. En bref, les gènes marqueurs dans les génomes ont été identifiés à l'aide de Prodigal 2.663 et alignés à l'aide de HMMER 3.364. Les arbres ont été déduits à l'aide de FastTree 2.1.1165 avec des modèles WAG + GMMA. L'amorçage a été effectué à l'aide de GenomeTreeTk v0.1.6 (https://github.com/dparks1134/GenomeTreeTk) avec 100 fois l'amorçage non paramétrique. Les arbres ont été visualisés à l'aide d'ARB 6.0.666 et importés dans Adobe Illustrator (Adobe, USA) pour un raffinement supplémentaire. La classification des génomes a été déterminée à l'aide du flux de travail "classify_wf" dans GTDB-Tk v1.5.167.

Les gènes d'ARNr 16S ont été identifiés dans le groupe 'Ca. MAG d'A. nitratireducens et génomes de Symbiobacteriia accessibles au public dans la base de données. Ces gènes ont été comparés à la base de données SILVA 138 SSU. Les séquences sélectionnées et les séquences prédites du gène de l'ARNr 16S ont été dérépliquées à l'aide du cd-hit 4.8.168. Au total, 112 séquences d'ARNr 16S ont été collectées et alignées à l'aide de SSU-align v0.1.169. L'arbre phylogénétique a été déduit à l'aide de FastTree 2.1.1165 avec les paramètres '-gtr -gamma'.

Pour les analyses phylogénétiques de AssA dans 'Ca. A. nitratireducens', 24 séquences de protéines de référence AssA et BssA, plus longues que 700 acides aminés (les numéros d'accès des séquences de référence sont fournis dans le tableau supplémentaire 6), ont été téléchargées à partir de bases de données publiques et alignées à l'aide du muscle 3.8.3170 avec le paramètre '-diags1 -maxiters 5'. Les lacunes dans msa ont été réduites à l'aide de trimAI 1.4.171. L'arbre phylogénétique a été déduit à l'aide de FastTree 2.1.1165. Pour la construction du gène de l'ARNr 16S et des arbres d'acides aminés AssA, le calcul de la valeur bootstrap et la visualisation de l'arbre étaient conformes à la construction de l'arbre génomique.

Des tests par lots en triple ont été effectués le jour 1100 dans trois récipients en verre de 650 ml avec un sous-échantillon de 500 ml de biomasse dans chaque récipient. La réduction des nitrates dans les bioréacteurs a été divisée en deux étapes. Au stade 1, le nitrate a été principalement converti en nitrite et en diazote gazeux avec une production négligeable d'ammonium, tandis qu'au stade 2, de l'ammonium et du diazote gazeux ont tous deux été produits. Pour la co-extraction de l'ARN et de l'ADN totaux, 10 ml d'une culture enrichie en actifs ont été collectés à partir de chaque test de lot à chaque étape et conservés en ajoutant une solution d'ARNlater (Sigma-Aldrich) et laissés au repos à température ambiante pendant 1 h. Le mélange a ensuite été filtré à travers un filtre en nitrate de cellulose stérilisé (0,20 μm ; Sartorius ; Göttingen, Allemagne). Pour capturer les micro-organismes pouvant passer à travers le filtre de 0,2 μm, le filtrat a été davantage concentré à l'aide d'un filtre Amicon® Ultra (Sigma-Aldrich) avec un seuil de poids moléculaire de 100 K. L'ARN et l'ADN totaux dans le filtrat concentré et le filtre en nitrate de cellulose ont ensuite été extraits en utilisant le kit RNeasy Powersoil Total RNA avec le kit RNeasy PowerSoil DNA Elution (Qiagen, Allemagne) selon les protocoles du fabricant. Les traces d'ADN génomique ont été éliminées des extraits d'ARN avec un kit sans ADN Turbo (Thermo Fisher Scientific, USA) suivi d'un kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research, USA). Le kit TruSeq Total RNA Library Prep with Ribo-Zero Plus a été utilisé pour la préparation de la bibliothèque d'ARN conformément au protocole du fabricant. La bibliothèque a été séquencée sur une plate-forme NextSeq500 (Illumina, États-Unis) à ACE (Brisbane, Australie) en 2 × 75 cycles appariés (tableau S1).

Les lectures générées ont été coupées à l'aide de ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) avec le paramètre "–remove_adap –minlen 60". Une base de données d'ARNr a été construite à partir d'ARNr 5 S archéaux et bactériens de 5SRNAdb72, de la base de données SSU de SILVA73 v138 et de la base de données LSU de SILVA v132. Les lectures de type ARN ribosomal ont été supprimées à l'aide de SortMeRNA 4.2.074 avec les paramètres par défaut et la base de données construite comme ci-dessus. Les lectures de qualité ont été mappées sur un ensemble de MAG dérépliqués et des échafaudages non regroupés à l'aide de bowtie2. Les alignements avec une longueur alignée <95 % de la longueur de lecture ou une identité <97 % ont été supprimés. La contamination potentielle par l'ADN des bibliothèques d'ARN a été identifiée à l'aide de RNAdir (https://github.com/jlli6t/RNAdir), une version modifiée de dirseq (https://github.com/wwood/dirseq). Ensuite, un test binomial a été effectué à l'aide de la fonction scipy.stats.binomtest. Les mappages ont été utilisés pour le calcul du TPM (transcriptions totales par million)75. Les niveaux d'expression totaux de chaque génome ont été calculés comme la somme des TPM de toutes les séquences codantes de chaque génome.

Pour l'extraction des protéines, 10 ml de culture d'enrichissement collectés à partir de tests par lots transcriptomiques ont été sédimentés par centrifugation (18 000 × g, 4 ° C), lavés avec 1 × PBS et stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse. Les culots cellulaires ont été lysés dans du dodécylsulfate de sodium à 5% (SDS), incubés avec du dithiothréitol 20 mM (concentration finale) à 70 ° C pendant 60 min, puis refroidis à température ambiante, suivis d'une alkylation avec de l'iodoacétamide 40 mM (concentration finale) dans l'obscurité pendant 30 min. Ensuite, 1,2 % d'acide phosphorique (concentration finale) et six volumes de tampon de liaison S-Trap (90 % de méthanol, 100 mM de concentration finale de bicarbonate d'ammonium, pH 7,1) ont été ajoutés. La protéine totale a été digérée dans une colonne S-Trap Micro Spin (ProtiFi, Huntington, USA) selon le protocole du fabricant76. En bref, la solution de protéines a été chargée sur le filtre S-Trap et centrifugée à 4 000 g jusqu'à ce que toute la solution soit passée. Le filtre a été lavé trois fois avec 150 μL de tampon de liaison S-Trap et digéré avec 1 μg de trypsine de qualité séquençage à 47 ° C pendant 1 h. Les peptides digérés ont été successivement élués en utilisant 40 ul de bicarbonate d'ammonium 50 mM, 0,1 % d'acide formique aqueux, 50 % d'acétonitrile et 0,1 % d'acide formique dans H2O. Les solutions de peptides ont été séchées avant d'être remises en suspension dans 20 ul d'acétonitrile à 5 % dans H2O. Les peptides ont été analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) à l'aide d'un système Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-LC couplé à un spectromètre de masse Q-ExactiveTM HX Hybrid Quadripole-Orbitrap™ (Thermo ScientificTM). Les données de séquençage brutes ont été traitées en recherchant les métagénomes annotés de 'Ca. A. nitratireducens' dans Thermo Proteome Discoverer (version 2.2.0.388). Les protéines identifiées contenaient au moins 1 peptide unique avec un seuil de stringence de taux de fausse découverte (FDR, valeur q) inférieur à 0,05.

Pour la préparation de l'extrait de métabolite, 5 mL de culture d'enrichissement ont été prélevés du bioréacteur. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (8000 × g, 10 min, 4 ° C) puis remises en suspension dans 1 ml de mélange acétonitrile-méthanol-eau (4: 4: 2, vol/vol/vol) dans des tubes de matrice de lyse (MP Biomedicals) avec des billes de verre. Les cellules ont été lysées à l'aide d'un homogénéisateur à billes fonctionnant pendant 5 cycles d'agitation réciproque à basse vitesse (3000 tr/min, 50 s) avec refroidissement sur glace (15 s) entre les étapes d'homogénéisation. Les extraits ont été séparés des débris cellulaires et des billes de verre par centrifugation à 18 000 g pendant 10 min à 4 ° C et stockés à -80 ° C jusqu'à l'analyse.

Les standards synthétisés sur mesure (succinate de propyle et d'isopropyle, Best of Chemicals, USA) et les extraits cellulaires ont été séchés dans un concentrateur sous vide rotatif (Concentrator Plus, Eppendorf), puis dérivés dans 20 μL de chlorure de méthoxyamine (30 mg/ml dans la pyridine) avec mélange continu pendant 2 h à 37 °C. Du N,O-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide (BSTFA, 20 μL) contenant 1 % de triméthylchlorosilane (TMCS) a ensuite été ajouté. Les échantillons ont été incubés sous agitation continue pendant 30 min à 37 ° C, puis analysés à l'aide d'un système GC/MS-TQ8050 triple quadripôle ultra-haute sensibilité (Shimadzu, Japon). Le système GC était équipé d'une source d'ionisation EI et fonctionnait en mode de surveillance de réactions multiples (MRM) pour la détection de composés. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit constant de 1,0 mL/min. Un microlitre de l'échantillon dérivé a été injecté dans un injecteur PTV en mode fractionné 1:10 avec une température d'injection de 280 °C. Les séparations ont été réalisées dans une colonne DB-5ms (95% polydiméthylsiloxane, 30 m × 0,25 mm × 1 μm) (Agilent JW Scientific). La température du four a été initialement maintenue pendant 1 min à 120 °C, puis augmentée à 220 °C à une vitesse de 8 °C/min, et enfin augmentée à 320 °C à 50 °C/min et maintenue pendant 1 min. La température de la source d'ions a été fixée à 200 °C. Les paramètres de spectrométrie de masse spécifiques ont été adaptés pour chaque composé afin de surveiller les ions de fragmentation pour chaque analyte (voir le tableau supplémentaire 7). Deux fragments d'ions provenant de la source d'ions EI ont été désignés puis fragmentés davantage dans la cellule de collision. Les trois transitoires les plus abondants ont été choisis pour être surveillés. Le transitoire 1 a été utilisé comme quantificateur et les deux autres comme qualificatifs.

FISH a été réalisé essentiellement comme détaillé par Daims, et al.77. La biomasse du bioréacteur a été fixée avec du paraformaldéhyde à 4 % (p/v) et stockée dans de l'éthanol à 50 % dans du PBS à -20 °C. Les sondes FISH ont été conçues à l'aide du logiciel ARB70 par rapport à la version 13873 de la base de données Silva SSU Ref NR99, y compris les séquences pertinentes générées à partir du bioréacteur d'enrichissement. En l'absence de toute séquence apparentée dans la base de données (>92% de similarité), les sondes ont été conçues contre la séquence 16S de 'Ca. A. nitratireducens' et des précautions doivent être prises dans leur application au-delà des systèmes bien caractérisés. Étant donné qu'il n'y a pas de représentants cultivés disponibles pour la validation de la sonde, trois sondes FISH ont été conçues pour cibler différents sites sur le 'Ca. ARNr 16 S d'A. nitratireducens pour donner une plus grande confiance dans leur spécificité. Celles-ci comprenaient les sondes SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) et SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ). Les sondes auxiliaires non marquées78 ont été conçues pour cibler les régions flanquantes de chaque site de sonde afin d'augmenter l'accessibilité au site cible pour un signal fluorescent optimal (SYMB-1018 : H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ ; SYMB-624 : H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - G AC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Les sondes auxiliaires ont été appliquées en quantités équimolaires avec leur sonde respective. Les extrémités 5' et 3' des sondes oligonucléotidiques FISH ont été marquées avec le fluorophore Cy3 et ont été synthétisées par Integrated DNA Technologies, Singapour. Un signal plus élevé a été obtenu pour ces sondes FISH avec un prétraitement au lysozyme de la biomasse (0, 5 mg ml-1 dans 0, 05 M EDTA, 0, 1 M Tris-HCl, pH 8) pendant 30 min à température ambiante. La sonde non-sens Non-EUB a été utilisée comme contrôle négatif d'hybridation79. La coloration au DAPI (1 ng/µl) des cellules a été réalisée pendant 15 min dans l'obscurité. La biomasse marquée a été visualisée avec un microscope confocal laser à lumière blanche Stellaris5 (Leica, Allemagne).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de séquençage sont archivées dans la base de données NCBI sous le numéro de projet PRJNA802347. Tous les projets de séquences nucléotidiques du génome ont été soumis au NCBI sous les numéros d'accès SAMN25643198 à SAMN25643256. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD031366. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions A. Oren (Université hébraïque de Jérusalem) pour ses suggestions sur la dénomination de 'Ca. A. nitratireducens', G. Talbo et L. Liu pour l'aide à l'extraction des protéines et à l'analyse des données protéomiques, Y. Wang et C. Lai pour l'aide au fonctionnement du bioréacteur, X. Zhang et S. Hu pour l'entretien du chromatographe en phase gazeuse, N. Clayton, N. Dawson et J. Li pour les analyses chimiques, A. Tabrett et A. McInnes pour l'aide à l'optimisation des sondes FISH, et E. Larsen pour l'aide à l'édition. JL est soutenu par la bourse de formation en recherche de l'UQ. JG, SM et GT sont soutenus par les Future Fellowships FT170100196, FT190100211 et FT170100070 de l'Australian Research Council (ARC), respectivement. ZY est soutenu par ARC Australian Laureate Fellowship (FL170100086).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Mengxiong Wu, Jie Li.

Centre australien de biotechnologie de l'eau et de l'environnement, Faculté d'ingénierie, d'architecture et de technologie de l'information, Université du Queensland, Sainte-Lucie, QLD, Australie

Mengxiong Wu, Jie Li, Zhiguo Yuan et Jianhua Guo

Centre de recherche sur le microbiome, École des sciences biomédicales, Université de technologie du Queensland (QUT), Institut de recherche translationnelle, Woolloongabba, QLD, Australie

Andy O. Leu, Gene W. Tyson et Simon J. McIlroy

Centre de recherche en biogéochimie côtière, Faculté des sciences et d'ingénierie, Université Southern Cross, Lismore, NSW, Australie

Dirk V. Soldats

Metabolomics Australia (Queensland Node), Institut australien de bioingénierie et de nanotechnologie, Université du Queensland, Sainte-Lucie, QLD, 4072, Australie

Terra Stark

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JG a conçu l'étude. MW, JG et SM ont planifié les expériences. MW a enrichi les micro-organismes dans le bioréacteur et effectué des expériences d'équilibre de masse et d'électrons et de marquage isotopique. DE a effectué les mesures d'azote isotopique. TS a mis en place des méthodes pour les analyses isotopiques du carbone et des métabolites. Sondes FISH conçues par SM et microscopie FISH réalisée. MW a réalisé l'échantillonnage, la conservation, les extractions d'ADN, d'ARN et de protéines pour le séquençage métagénomique, métatranscriptomique et métaprotéomique. MW, JG et ZY ont effectué l'analyse des données de processus. JLAL, MW, GT, SM et JG ont effectué l'analyse de la communauté microbienne et l'analyse bioinformatique. MW, JL, ZY, SM et JG ont rédigé le manuscrit en consultation avec tous les autres auteurs.

Correspondance à Simon J. McIlroy ou Jianhua Guo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Florin Musat et l'autre relecteur, anonyme, pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

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Wu, M., Li, J., Leu, AO et al. Oxydation anaérobie du propane couplée à la réduction des nitrates par une lignée au sein de la classe Symbiobacteriia. Nat Commun 13, 6115 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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Reçu : 12 avril 2022

Accepté : 05 octobre 2022

Publié: 17 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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