Identification, isolement et caractérisation structurelle de nouveaux produits de dégradation forcée de l'ertugliflozine à l'aide de techniques analytiques avancées

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9472 (2023) Citer cet article

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La recherche élucide le comportement de dégradation du stress de l'ertugliflozine, qui est utilisée pour le traitement des diabétiques de type 2. La dégradation a été effectuée conformément aux directives de l'ICH et l'ertugliflozine est relativement stable dans des conditions d'hydrolyse thermique, photolytique, neutre et alcaline ; cependant, une dégradation considérable a été détectée dans l'hydrolyse acide et l'hydrolyse oxydative. Les produits de dégradation ont été identifiés par chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse, isolés par chromatographie liquide haute performance semi-préparative et caractérisation structurale à l'aide de la spectrométrie de masse haute résolution et de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Au total, quatre produits de dégradation ont été identifiés et isolés dans la dégradation acide, qui sont les produits de dégradation 1, 2, 3 et 4. Alors que dans des conditions oxydatives, le produit de dégradation 5 a été identifié. Les cinq produits de dégradation formés sont tous nouveaux, ce qui n'a pas été signalé auparavant. Il s'agit de la première caractérisation structurelle complète documentée des cinq produits de dégradation à l'aide d'une technique analytique à trait d'union. La masse à haute résolution et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ont été utilisées dans la présente étude pour obtenir une confirmation concrète des structures des produits de dégradation. La méthode actuelle est également utilisée pour identifier les produits de dégradation avec une durée d'exécution plus courte à l'avenir.

Dans les médicaments contre le diabète de type 2, l'ertugliflozine est utilisée comme inhibiteur1,2,3. Il est disponible en tant que médicament solitaire et combiné avec la sitagliptine et la metformine HCl. La littérature disponible sur le marché révèle certaines validations de développement de techniques analytiques et bioanalytiques, et la stabilité suggérant que des enquêtes sont accessibles avec le médicament (Ertugliflozine) et le mélange de sitagliptine et de metformine. Le médicament Ertugliflozin (nom de marque Steglatro) est utilisé pour traiter le diabète de type 2. La Food and Drug Administration a autorisé son utilisation en monothérapie et en association à dose fixe avec la sitagliptine ou la metformine aux États-Unis4. Son utilisation en tant que monothérapie ou traitement combiné a été approuvée en Europe en mars 2018. L'ertugliflozine appartient à la famille des médicaments connus sous le nom de gliflozines et est un inhibiteur du SGLT2. Segluromet est vendu en association avec la metformine et Steglujan est proposé en association avec la sitagliptine.

L'ertugliflozine est commercialisée sous le nom de marque Steglatro. Sa formule moléculaire est C22H25ClO7 (Mol. Wt. : 436,13) et le nom chimique est 5-(4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)-1-(hydroxyméthyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-2,3,4-triol. L'ertugliflozine se présente sous forme de sel d'acide pyroglutamique et se présente sous la forme d'une poudre cristalline blanche non hygroscopique. Il est soluble dans l'acétone et l'éthanol, légèrement soluble dans l'acétonitrile et l'acétate d'éthyle, et seulement dans l'eau peu soluble. La figure 1 résume la structure de l'ertugliflozine et de ses produits de dégradation. L'examen de la littérature a découvert peu de publications sur l'analyse de l'Ertugliflozine unique et combinée avec la metformine et la sitagliptine. Le développement de la stratégie de l'ertugliflozine a été rapporté pour sa combinaison avec la metformine RP-HPLC5,6,7,8,9,10,11, avec la sitagliptine12,13,14,15,16,17,18, en combinaison avec la metformine et la sitagliptine19. Plusieurs stratégies bioanalytiques utilisant des approches LC-MS/MS ont été rapportées pour détecter la sitagliptine dans le plasma et l'ertugliflozine20,21. Cependant, jusqu'à présent, aucune littérature n'était disponible pour expliquer les produits de dégradation de l'ertugliflozine et leur caractérisation. Aucune des publications n'a fourni les études RMN, spectrométrie de masse à haute résolution et IR des produits de dégradation. La présente étude explique la caractérisation structurelle détaillée des 5 produits de dégradation de l'ertugliflozine. Par conséquent, la recherche actuelle s'est efforcée de fournir des preuves concrètes des structures des produits de dégradation, ce qui impliquait le développement de la méthode chromatographique de la méthode UHPLC-MS pour l'ERG et ses 5 produits de dégradation, bien résolus en 4 minutes d'exécution avec les expériences HRMS/MS, IR et RMN (1D, 2D).

Structures de l'ertugliflozine et de ses produits de dégradation.

Un échantillon de cadeau pharmaceutique actif d'ertugliflozine a été obtenu auprès d'organisations pharmaceutiques de premier plan à Hyderabad. Les réactifs et les produits chimiques utilisés pour la recherche étaient l'hydroxyde de sodium, l'acide chlorhydrique, le peroxyde d'hydrogène à 30 % (qualités analytiques), l'acide formique (qualité LCMS), l'acétonitrile (qualité HPLC), acheté auprès de Honeywell Research Chemicals, Inde. L'eau utilisée pour l'analyse provenait d'un instrument milli-Q de Millipore, Amsterdam, Pays-Bas. Diméthylsulfoxyde-d6 (qualité RMN) de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. D, 99,9 % + 0,03 % v/v.

Les instruments d'analyse et les logiciels pris en charge engagés pour le présent travail sont l'instrument UHPLC-MS d'Acquity UHPLC frontend avec un détecteur quadripolaire simple waters et le logiciel maslynx 4.2. Instrument HRMS de Thermo avec Dionex ultimate 3000 LC frontend q-exactive orbitrap MS avec source d'ions ESI et logiciel x-calibur. Instrument de purification du module binaire Waters 2545, du détecteur-2489 et de l'échantillonneur automatique 2707 avec le logiciel chrom scope-2.1. Instrument RMN de Bruker Avance neo 400 MHz avec logiciel topspin 4.09. Balance analytique de Sartorius-SQP-F et instrument de spectroscopie infrarouge de Shimadzu ir-afinity-1S et logiciel de solution de laboratoire.

La résolution de la chromatographie en phase liquide a été obtenue sur le détecteur de masse quadripolaire unique (SQD2) de Waters associé à l'interface frontale du détecteur UHPLC et photodiode (PDA) d'Acquity. Double polarité - négative et positive avec une source ESI (ionisation par électrospray) avec un spectromètre de masse quadripolaire unique à eau a été utilisé pour l'analyse de masse L'optimisation MS a été effectuée en utilisant le mode de balayage de 100 à 1200 Daltons (Da). La température de désolvatation a été maintenue à 350°C. 700 L h-1 de gaz ont été fixés pour le débit de désolvatation et celui de gaz de cône a été fixé à 60 L h-1. L'instrument de chromatographie liquide-spectromètre de masse a été utilisé à l'aide du gestionnaire d'applications MassLynx 4.1. Les échantillons ont été maintenus à une température de 10 °C et ont été exécutés avec une durée d'exécution chromatographique plus courte de 4,0 min et un volume d'injection de 0,5 µL.

Dans la poursuite d'une méthode appropriée, fiable et reproductible, différents tampons utilisant différentes colonnes ont été criblés pour optimiser la résolution. Initialement, le développement de la méthode a été effectué à l'aide d'acide trifluoroacétique, d'acide formique, de tampons de bicarbonate d'ammonium et de différentes colonnes comme l'acuité phényle, C18 et CSH C18. Au cours de nombreux essais, un tampon d'acide formique à 0,1 % avec acquity BEH C18 a montré des résultats positifs et encourageants et les essais restants ont obtenu une résolution médiocre ou une résolution. De plus, des essais approfondis ont été effectués sur la colonne acquity BEH avec diverses conditions de débit et de gradient. La séparation optimale de tous les produits de dégradation et de l'API a été obtenue sur la colonne Waters Acquity UPLC BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 µm). La phase mobile comprenait les phases mobiles A et B ayant 0,1 % d'acide formique dans l'eau et 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile. La séparation a été obtenue à l'aide du programme de gradient Temps (min)/B conc (%) : 0/3, 0,5/3, 2,5/98, 3,5/98, 3,6/03, 4/03 à un débit de 0,4 mL min-1 et une température de colonne de 35 °C. Un détecteur à barrette de photodiodes (PDA) a été utilisé pour surveiller les éluants. Le diluant utilisé dans le rapport 1:1 (v/v) mélange d'eau et d'acétonitrile. Les 6 pics ont été séparés avec une bonne forme de pic et une bonne résolution dans cette condition. La trace finale de développement de la méthode est illustrée à la Fig. 2, et les traces de dégradation sont illustrées à la Fig. 3.

Développement de la méthode de l'Ertugliflozine et de ses produits de dégradation dans la colonne acquity BEH C18.

Voie de dégradation de l'ertugliflozine hydrolyse acide (A) et hydrolyse oxydative (B).

Les échantillons ont été analysés à l'aide d'une source ESI équipée d'un orbitrap MS Thermo Q Exactive ; UHPLC Dionex Ultimate 3000 avec détecteur PDA comme frontal. Les paramètres de source d'instrument utilisés étaient la tension de pulvérisation : 3,5 kV ; Débit de gaz auxiliaire : 14 ; Température capillaire : 270 °C ; Débit de gaz de balayage : 3 ; Chauffage auxiliaire au gaz Température : 440 °C. Débit de gaz gaine : 53. Les données de masse ont été acquises à l'aide du logiciel xcalibur. La réserpine (masse monoisotopique : 608,2734 Da) a été utilisée comme étalon pour vérifier la précision de l'analyseur de masse. Les conditions chromatographiques étaient comme UHPLC-MS. Les données HRMS pour tous les produits de dégradation sont présentées à la Fig. 4. Les données de fragmentation de masse obtenues dans l'analyse HRMS-MS pour tous les produits de dégradation sont présentées au tableau 1.

Données HRMS et HRMS-MS pour l'ertugliflozine et ses produits de dégradation.

HPLC semi-préparative Waters 2489 double détecteur UV, module de pompe 2545 et gestionnaire d'échantillons 2707 avec collecteur de fractions automatique-III. L'ensemble de l'instrument a été contrôlé avec le logiciel ChromScope-2.1, et le Luna C18 150 × 25 mm, 5 µm emballé en interne a été utilisé pour isoler les produits de dégradation. Toutes les fractions pures isolées ont été lyophilisées à l'aide du lyophilisateur Lyofreeze.

Une dégradation a été observée dans des environnements acides et peroxydés. Pour neutraliser l'échantillon hydrolysé à l'acide, une solution saturée de (NH4)2CO3 a été utilisée et la solution résultante a été solidifiée par lyophilisation. Après dilution de la solution de peroxyde, évaporer pour obtenir un solide libre. Pour la purification HPLC préparative, l'échantillon identique a été dissous dans une petite quantité de la phase mobile.

Les spectres RMN 1H, 13C et 2D de l'ertugliflozine et des produits de dégradation ont été analysés dans du solvant DMSO-d6 sur un instrument RMN Bruker Avance Neo 400 MHz fourni avec une sonde d'observation à large bande de 5 mm (BBO) avec un système de cale de gradient Z avec des sensibilités de 225: 1 et 480: 1. Le signal TMS (tétraméthylsilane) à zéro ppm a été utilisé comme référence pour 1H et le signal septet de 39,5 ppm de DMSO-d6 pour 13C.

Le modèle Shimadzu IR-Afinity-1S avec un logiciel de solutions de laboratoire a été utilisé pour reconnaître les groupes fonctionnels tels que l'alcool, la cétone et la chlorocétone présents dans les composés. KBr a été utilisé comme milieu de dispersion pour préparer les pastilles d'échantillon.

Conformément aux directives de stabilité de l'ICH22,23,24,25,26, divers paramètres de dégradation forcée ont été utilisés, c'est-à-dire des conditions d'hydrolyse thermique, photolytique, neutre, acide et basique. Une étude de dégradation forcée de l'ERG a été réalisée comme mentionné dans les directives de l'ICH pour l'étude de stabilité. La solution standard ERG (10 mg mL-1), un millilitre de la solution a été transféré dans une fiole jaugée de 10 mL et dilué jusqu'au trait avec une solution de peroxyde d'hydrogène à 30 %. La solution a été agitée à température ambiante. Un millilitre de la solution a été prélevé et complété à 10 ml avec de l'eau ACN (1:1 v/v). Pour obtenir une concentration finale de 100 µg mL−1, il a fallu poursuivre les études pour obtenir le comportement de dégradation. Pour la photodégradation, 25 mg d'échantillon d'ERG ont été exposés à une lumière UV de 254 nm pendant 48 h dans une chambre UV. Pour la dégradation thermique, 25 mg d'échantillon d'ERG ont été conservés à 100 ° C pendant 48 h et ont été utilisés pour d'autres études afin d'observer le comportement de dégradation.

Pour l'étude de l'hydrolyse neutre, acide et basique, une solution mère standard d'ERG (10 mg mL-1) a été préparée dans de l'ACN et de l'eau (1: 1 v / v). 1 ml de solution mère standard d'ERG a été transféré dans une fiole jaugée de 10 ml. Complétez ensuite jusqu'au trait en utilisant de l'eau pour la dégradation neutre, du NaOH 1 N pour la dégradation alcaline et du HCl 1 N pour la dégradation acide (initialement, la même procédure a été effectuée avec du NaOH 0,1 N et du HCl 0,1 N. Cependant, aucune dégradation considérable n'a été observée, de sorte que la force de l'acide et de la base a été augmentée à 1 N). La solution a été maintenue sous agitation à une température de 60°C. Un millilitre de la solution a été prélevé, neutralisé et transféré dans une fiole jaugée de 10 ml. Puis le volume a été complété au trait avec de l'eau pour obtenir une concentration finale de 100 µg mL-1. Il a été pris pour d'autres études pour obtenir le comportement de dégradation.

Le composé ERG est très stable dans des conditions neutres, d'hydrolyse basique, photolytique et thermique et n'a montré aucune dégradation, ce qui confirme la stabilité de l'ERG dans les conditions ci-dessus. Le médicament s'est avéré labile à l'hydrolyse acide et aux conditions de peroxyde. En conséquence, ~ 15 à 20 % de dégradation ont été observées à la fois dans le peroxyde (30 % H2O2 sous agitation à température ambiante, jusqu'à 48 h) acide (1 N HCl avec reflux à 60 °C sous agitation, jusqu'à 48 h) et conditions. Les conditions de dégradation détaillées et les résultats sont présentés dans le tableau 2, et les chromatogrammes de dégradation des conditions d'hydrolyse acide et de peroxyde sont présentés à la figure 3. Dans des conditions d'hydrolyse acide, 4 DP ont été formés (DP-1, DP-2, DP-3 et DP-4), alors que, dans des conditions oxydatives, un produit de dégradation (DP-5) s'est formé. Les structures confirmées de tous les DP sont révélées à la Fig. 1.

La formation d'impuretés de dégradation était la suivante, pour la formation de DP1, la substitution électrophile initiale à médiation acide du formaldéhyde protoné en position ortho comme dans le composé 1 suivie d'une chimie de Ritter avec de l'acétonitrile a donné DP1. Selon la littérature du Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–62927, le fragment sucre dans la molécule cible subit une décomposition progressive pour former du formaldéhyde dans des conditions acides chaudes. Ceci lors de la réaction avec la molécule cible en milieu acide (comme indiqué dans le manuscrit) favorise la formation de 3. Celui-ci réagit à son tour avec l'acétonitrile (utilisé comme solvant à des fins de solubilité) pour former DP-1 par la chimie de Ritter.

Formation de DP2, la voie de dégradation proposée pour la formation de DP2 est basée sur la littérature (Chemical Engineering Journal 307, 2017, 877-883)28 dans des conditions acides de Bronsted.

Formation de DP3/DP4, selon la littérature du Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 113 (2015) 621–629, le fragment sucre dans la molécule cible subit une décomposition progressive pour former du formaldéhyde/acétaldéhyde et de l'acide acétique dans différentes proportions29,30. L'acide acétique formé impliqué dans l'estérification du DP2 dans la condition acide chaude existante. De la même manière, le groupe hydroxyméthyle libre subit une chloration via le mécanisme SN2. En conséquence, l'acide protone le groupe hydroxyle et est successivement déplacé par le chlorure pour former le DP4 correspondant.

Formation de DP5, le mécanisme proposé pour la formation de DP5 est le clivage oxydatif du groupe aryl éthoxy pour former le phénol correspondant, c'est-à-dire DP5.

À l'aide de la spectrométrie de masse (UHPLC-MS), des échantillons individuels ont été analysés pour déterminer les résultats de toutes les études de stress. Tous les dégradants formés au fil du temps, et à partir de chaque contrainte, les conditions d'étude sont décrites dans la section expérimentale. Cinq produits de dégradation substantiels ont été identifiés, isolés et caractérisés par les techniques UHPLC-MS, Prep-HPLC, HRMS, 2D-NMR et FTIR. La plupart de ces produits de dégradation sont formés par le réarrangement du cycle glucidique à six membres de l'API en un cycle furane à cinq membres.

Les produits de dégradation formés en pourcentage considérable de > 5 % à la suite de la dégradation ont été observés dans des conditions de peroxyde et de stress acide. Une colonne Luna C18 (150 mm × 25 mm, 5 μm) et de l'acétonitrile, 0,1% d'acide formique en solution aqueuse ont été utilisés comme phase mobile pour la purification. Des injections consécutives de solutions d'échantillons bruts ont été injectées et la collecte des fractions a été effectuée en fonction de la réponse UV et de la masse ultérieure confirmée par LC-MS. Recueillir séparément des fractions de divers produits de dégradation et les lyophiliser pour obtenir un solide libre.

Pour obtenir les informations structurelles de l'API Ertugliflozin, toutes les données analytiques ont été enregistrées à des fins de référence. Dans des conditions de mode positif ESI – MS, les ions [M + H] + et l'adduit d'ammoniac [M + H + NH3] + ont été détectés comme 437,1350 et 454,1617, respectivement, ce qui confirme que la formule moléculaire de l'ertugliflozine est C22H25ClO7. Les données confirmées de l'ertugliflozine sont mentionnées au spectre HRMS, HRMS/MS (Fig. 4, Tableau 1), IR (Tableau 4). Le mécanisme provisoire proposé par HRMS / MS pour les ions de fragmentation protonés de l'ERG est présenté dans les données supplémentaires de la Fig. S1. Le mécanisme structurel proposé pour expliquer le comportement de dégradation de l'ertugliflozine dans des conditions hydrolytiques acides et de peroxyde est illustré à la Fig. 5, et la conformation structurelle de l'ERG à l'aide de la 2D-RMN est illustrée aux Figs. 6 et S2. La conformation structurelle de l'ERG est effectuée par HRMS et 2D-NMR. Tous les autres produits de dégradation sont caractérisés sur la base de la comparaison de ces données d'élucidation structurale.

Comportement de dégradation proposé de l'ertugliflozine dans des conditions hydrolytiques acides et de peroxyde.

Spectres RMN illustratifs pour ERG, DP-1 et DP-2.

Le traitement à l'ertugliflozine avec un acide a entraîné le produit de dégradation-1 (DP-1). Ce produit de dégradation a été isolé et sa masse a été confirmée comme étant [M + H] + 508,1724 (erreur de − 1,7675 ppm) dans HRMS pour la formule moléculaire C25H30ClN5O8 illustrée à la Fig. 4. Le spectre HRMS confirme la présence d'un atome de chlore dans la structure. La structure complète du produit de dégradation a été déterminée par des études RMN et HRMS. L'échantillon a été préparé dans du solvant DMSO-d6 et soumis à une analyse RMN. Expériences d'échange de RMN 1H et de D2O initialement enregistrées. La comparaison des données 1H et D2O confirme la présence de cinq protons échangeables dans le composé et dans la région aromatique manquant de motif de cycle 1,4 disubstitué et présence du motif de cycle 1,2,4 trisubstitué. La principale différence avec le composé API est la présence d'amide secondaire (H32), de protons de méthylène (H31) et d'un groupe acétyle (H34). En RMN 1H, un total de 30 protons étaient présents, l'amide secondaire est à 8,08 ppm et les protons aromatiques ont été montrés entre 6,0 et 8,0 ppm. Les protons alcooliques primaires et secondaires sont à 4,5–5,5 ppm et la résonance des protons aliphatiques entre 1,0 et 4,5 ppm. Les protons de N-méthylène apparaissent à 4,15 ppm et les protons d'acétyle à 1,85 ppm. O-méthylène est à 4,00 ppm et les protons de méthylène aromatique sont à 3,97 ppm. Dans la RMN 13C, un total de 25 carbones étaient visibles ; la plupart du carbone en aval est l'acétamide carbonyle montrant à 169,26 ppm, suivi du carbone quaternaire attaché au groupe O-éthyle à 154,36 ppm. Les carbones aromatiques restants se situaient entre 100 et 140 ppm, les carbones aliphatiques apparaissant entre 10 et 90 ppm. Dans l'expérience HSQC confirmée comme H31, les carbones attachés aux protons de méthylène apparaissent à 37,16 ppm et le carbone attaché aux protons de N-acétyle apparaît à 22,47 ppm. Dans l'expérience gDQ-COSY, les protons H31 ont montré une corrélation avec le proton H32. Dans l'expérience HSQC 1H-15N, le proton H32 a été confirmé comme un proton NH amidique, et sa valeur d'azote s'affiche à 115 ppm. Dans l'expérience HMBC 1H-13C, les protons H31, H32 et H34 ont montré une connectivité au carbone C33, et les protons H31 ont montré une connectivité aux carbones C9, C10 et C11. Toutes les informations clés des données RMN 1D et 2D confirment que le cycle 1,4 disubstitué s'est converti en benzylacétamide. Enfin, il a formé du N-(5-(2-chloro-5-(2,3,4-trihydroxy-1-(hydroxyméthyl)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-5-yl)benzyl)-2-éthoxybenzyl)acétamide et le spectre RMN 2D a été représenté sur les Fig. 6 et S3. Les déplacements chimiques figuraient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était illustré à la figure 5.

De plus, la fréquence d'étirement à 3415 cm-1 dans les spectres FT-IR spécifie la présence de groupes NH et OH, et la fréquence d'étirement à 1645 cm-1 dirige la présence de groupes amide céto. La fréquence d'étirement à 811 cm−1 conduit à l'existence du groupe C–Cl. Un spectre FT-IR significatif a établi l'existence de groupes fonctionnels céto, amide, alcool et chlorure, comme présenté dans le tableau 4. Pour DP-1, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés ont été présentés dans les Fig. 4 et S1.

Le composé DP-2 a été formé dans l'hydrolyse acide du composé ERG. Pour acquérir des informations structurelles, une analyse DP-2 HRMS a été effectuée et 371,1037 [M + H] + a été obtenu en tant que molécule protonée avec une erreur de − 2,0463 ppm pour la formule moléculaire calculée C21H19ClO4 illustrée à la Fig. 4. Le spectre HRMS confirme la présence d'un atome de chlore dans la structure et la masse du produit de dégradation a 66 unités de moins que l'Ertugliflozine mère. Pour obtenir la structure méticuleuse du produit de dégradation, des expériences de RMN 1D et 2D ont été réalisées. Les données RMN 1H de DP-2 ont montré des différences extrêmes par rapport au composé API. Ici, nous ne pouvions pas voir les protons du cycle bicyclique et avons remarqué le proton de l'alcool primaire à 5,56 ppm sous forme de triplet, il a été échangé dans un échange D2O. Les protons de méthylène apparaissent sous la forme d'un doublet à 4,51 ppm, les protons du cycle de furane apparaissant à 6,59 et 7,28 ppm avec une valeur J de 3,2 Hz. Dans le cycle 1,4 disubstitué de la région aromatique, des protons à motif trisubstitué 1,2,4 étaient présents comme le composé parent à 6–8 ppm, et dans la région aliphatique des protons O-éthoxy, des protons méthylène ont été montrés entre 1,0 et 4,5 ppm. En RMN 13C, un total de 19 carbones ont été montrés en raison de la symétrie des carbones C9 – C13 et C10 – C12 montrant chacun comme un signal. La plupart du carbone en aval est une cétone, et il résonne à 180,11 ppm. Les carbones quaternaires du cycle furanne sont affichés à 150,15, 161,7 ppm et le carbone aryle lié à l'O-éthoxy est à 157,05 ppm; les carbones aryle restants apparaissent à 110–140 ppm. Dans la région aliphatique, 4 carbones montraient, le carbone de méthylène clé est à 55,94 ppm, par l'expérience HSQC a confirmé la même chose. Une autre information clé de l'expérience HSQC est l'identification des carbones protonés du cycle furane. À partir de l'expérience COSY, le proton d'alcool primaire H26 a montré une corrélation avec les protons de méthylène H25, et les protons du cycle furane H21, H22 sont montrés en corrélation les uns avec les autres. De l'expérience g-HMBC confirme les protons H25 montrant la connectivité aux carbones C22 et C23 et les protons H1, H3 montrent la connectivité au carbone C18. Sur la base des données de RMN, il a été conclu que le cycle bicyclique a été réarrangé et a formé des cycles de furane à 2,5 cycles substitués comme la structure représentée sur les Fig. 6 et S4 et forment la (4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)(5-(hydroxyméthyl)furan-2-yl)méthanone. Les déplacements chimiques figuraient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était illustré à la figure 5.

De plus, la fréquence d'étirement à 3481 cm-1 dans les spectres FTIR confirme la présence de groupes OH, et la fréquence d'étirement à 1637 cm-1 spécifie la présence de groupes céto. La fréquence d'étirement à 756 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Les fréquences significatives FT-IR ont établi l'existence de groupes fonctionnels alcool, céto et chloro, comme illustré dans le tableau 4. 4 et S1.

L'hydrolyse acide du composé ERG a donné le composé DP-3. Pour acquérir des informations structurelles_ de DP-3, une analyse HRMS a été exécutée et a observé la molécule protonée [M + H] + comme 413,1139 avec une erreur de − 2,8246 ppm, ce qui confirme la formule moléculaire calculée C23H21ClO5 illustrée à la Fig. 4. La masse du produit de dégradation a moins de 24 unités que celle de l'ERG, et pour connaître la structure exacte. De plus, des expériences de RMN ont été enregistrées. DP-3 composé 1D RMN est presque comme le DP-2, peu de différence observée, au lieu de proton alcoolique vu groupe acétyle. En RMN 1H, un nombre total de 21 protons sont présents, avec ces 9 protons de la région aromatique et les protons du cycle furane indiqués à 6,79 et 7,32 ppm avec J = 3,6 Hz. Dans la région aliphatique, un nombre total de 12 protons étaient présents, en ce sens que 3 groupes méthylène montraient entre 3,5 et 5,5 ppm, et les protons du groupe acétyle montraient à 2,07 ppm. En RMN 13C, le nombre de carbones est de 21, dans ces 16 carbones de la région aromatique et 5 carbones de la région aliphatique. Le carbone le plus bas est la cétone à 180,22 ppm, suivie par l'O-acétyle à 169,86 ppm et le carbone aryle lié à l'O-éthoxy à 157,05 ppm. Les carbones quaternaires du cycle furane sont à 150,92 et 154,92 ppm, les carbones protonés sont à 122,12 et 112,85 ppm, les carbones restants ont été montrés entre 110 et 140 ppm, les carbones aliphatiques ont été montrés à 10–65 ppm. Pour identifier les carbones protonés à partir du nombre total de carbones, une expérience HSQC a été menée et elle confirme que les carbones O-méthylène C25 sont à 57,47 ppm et C15 à 62,86 ppm et que les carbones protonés du cycle furane étaient à 122,12 et 112,85 ppm. Dans l'expérience COSY H21, les protons H22 montrent des corrélations. Pour vérifier les corrélations 2J et 3J, l'expérience HMBC composée de DP-3 a beaucoup aidé, ici les corrélations clés étaient H25, les protons H28 montrent la connectivité au carbone C27, H25 a montré la connectivité aux carbones C22, C23 également et H1, les protons H3 montrant la connectivité au carbone C18 ainsi que ces connectivités restantes s'adaptent à la structure. La structure du produit de dégradation-3 était l'acétate de (5-(4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)benzoyl)furan-2-yl)méthyle, et le spectre RMN 2D a été représenté sur les Fig. 7 et S5. Les déplacements chimiques figuraient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était illustré à la figure 5.

Spectres RMN illustratifs pour DP-3, DP-4 et DP-5.

Une confirmation supplémentaire effectuée avec FT-IR et une fréquence d'étirement de 1744 et 1645 cm-1 indique la présence de groupes céto, et des signaux à 1349, 1039 cm-1 confirment la présence de groupes C – O. Aucun signal dans la région de 3400–3000 cm−1 confirme que les protons OH et NH ne sont pas présents dans la structure. La fréquence d'étirement à 756 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Un spectre FT-IR significatif a confirmé la présence de groupes fonctionnels céto et chloro, comme indiqué dans le tableau 4. Pour DP-3, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont illustrés aux Fig. 4 et S1.

DP-4 a entraîné le traitement de l'ERG avec de l'acide. Après isolement, HRMS a été enregistré pour connaître sa masse. Pour les informations structurelles de DP-4, une analyse HRMS a été effectuée et a obtenu la molécule protonée [M + H] + 389,0694 avec une erreur de − 2,9529 ppm pour la formule moléculaire C21H18Cl2O3 illustrée à la Fig. 4 et le spectre HRMS ayant le motif dichloro qui conforme le composé ayant deux atomes de chlore. Il a 48 unités de moins par rapport au composé ERG parent. Des études RMN ont déduit la structure précise du DP-4. L'échantillon a été préparé dans du solvant DMSO-d6 et les analyses RMN 1D et 2D requises ont été effectuées pour découvrir la structure de DP-4. Dans les données RMN 1H montrent 18 protons, et une différence mineure a été observée entre les données RMN 1H de DP-2 et DP-4, c'est-à-dire qu'il manque le proton alcoolique, dans DP-4, le méthylène H25 apparaît sous forme de singulet à 4,93 ppm. Les protons de l'anneau de furane ont été montrés à 6,82 et 7,31 ppm avec J = 3,6 Hz. Deux forts doublets H9, H13 et H10, H12 apparaissent à 7,15, 6,86 ppm, les protons H1, H2 et H3 se situent entre 7,5 et 7,9 ppm, et les protons aliphatiques se situent entre 1 et 5 ppm. En RMN 13C, le nombre de carbones est de 19, en raison de la nature symétrique dans le cycle 1,4-disubstitué au lieu de 6 observés 4 signaux. La plupart des carbones en aval sont des cétones qui résonnent à 180,21 ppm, le reste des carbones se situant entre 110 et 160 ppm. Dans la région aliphatique, quatre carbones étaient présents, le carbone clé du méthylène en C25 est à 36,88 ppm, les carbones O-éthoxy sont à 14,63 et 62,86 ppm, le carbone du méthylène C7 est à 37,37 ppm. L'expérience HSQC a validé les carbones protonés, les décalages de carbone protonés du cycle furane montrant à 122,26 et 112,62 ppm. Dans les expériences HMBC observées, deux connectivités importantes dans ce proton H25 montrent une corrélation 2J avec le carbone C23 et une corrélation 3J avec le carbone C22. La deuxième connectivité importante est H1, les protons H3 montrant la connectivité carbone C18. Toutes les informations importantes des données RMN confirment que le cycle bicyclique a été réarrangé et que le cycle furane substitué en 1,5 a été formé. En conséquence, la structure formant la (4-chloro-3-(4-éthoxybenzyl)phényl)(5-(chlorométhyl)furan-2-yl)méthanone et le spectre RMN 2D ont été représentés sur les Fig. 7 et S6. Les déplacements chimiques figuraient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était illustré à la figure 5.

Le spectre FTIR indique la présence du signal 1649 cm-1 indique la présence du groupe céto, et les signaux à 1305 et 1246 cm-1 indiquent la présence des groupes C–O. La fréquence d'étirement à 841 703 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Aucun seul dans la région de 3400–3000 cm−1 ne confirme que les protons OH et NH ne sont pas présents dans la structure. Les signaux FT-IR dans le spectre sont conformes à la structure des groupes fonctionnels Chloro et céto, comme indiqué dans le tableau 4. Pour DP-4, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont illustrés dans les Fig. 4 et S1.

Le produit de dégradation-5 a été formé en traitant le composé API avec du peroxyde d'hydrogène. Pour les informations structurelles DP-5, une analyse HRMS a été effectuée et a observé la molécule protonée [M + H] + de 409.1037 avec une erreur de − 2.9086 ppm pour la formule moléculaire C20H21ClO7 illustrée à la Fig. 4. D'après les données de masse, il est entendu que 28 unités étaient inférieures au composé API parent et avaient un atome de chlore dans la structure. Des études RMN ont fait la caractérisation complète de DP-5. Nous avons enregistré des expériences de RMN obligatoires pour un échantillon dissous dans du DMSO-d6. Expériences primaires de RMN 1H et D2O indiquant que, dans les données de RMN 1H montrant 21 protons, dans l'expérience d'échange de D2O, 5 protons ont été échangés et montrant 16 protons. Ainsi confirmé la présence de cinq protons labiles dans le composé. La principale différence entre le composé DP-5 et le composé parent est l'absence de groupe O-éthoxy et la présence de proton OH phénolique à 9,24 ppm; les 4 protons labiles restants montrent entre 4,5 et 5,5 ppm (1° et 2° alcoolique). Dans la région aromatique, les protons du cycle 1,4 disubstitués sont à 6,66 et 6,97 ppm, les protons du cycle chloro substitués sont à 7,1–7,5 ppm, les protons aliphatiques de méthine et de méthylène se situent entre 3 et 4 ppm. Dans la RMN 13C, 7 carbones apparaissaient dans la région aliphatique et 11 signaux apparaissaient dans la région aromatique. Plus le carbone déblindant est le carbone quaternaire localisé OH phénolique, les signaux aromatiques restants ont été montrés entre 100 et 140 ppm. Dans la région aliphatique, les carbones méthylène et méthine attachés à O montraient entre 55 et 90 ppm, les carbones méthylène aromatiques sont à 37,70 ppm. dans l'expérience HSQC a confirmé les déplacements des carbones méthylène et méthine. Dans l'expérience COSY, le proton H24 a montré une connectivité avec H19, H23 montre avec H20, le proton H22 est avec le proton H21 et H28 montre une corrélation avec les protons H25. Ces connectivités sont aidées pour identifier les protons méthine et méthylène. Dans l'expérience HMBC, peu de corrélations 3J importantes sont observées. Les protons H1, H3 et H27 montrent une connectivité au carbone C16. En outre, les protons H7 montrant la connectivité 3J à C3, C5 et C9, C13 ; Connectivité 2J aux carbones C4, C8. Les données de RMN et de masse ont confirmé que le groupe éthoxy partait du parent et formait un OH phénolique sur le cycle 1,4 disubstitué. La structure du DP-5 a été élucidée et le spectre RMN représenté sur les Fig. 7 et S7. Les déplacements chimiques figuraient dans le tableau 3 et le mécanisme de dégradation proposé était illustré à la figure 5. L'analyse FT-IR confirme également la présence du groupe OH à une fréquence d'étirement de 3443 cm-1. La fréquence d'étirement à 755 cm−1 dirige la présence du groupe C–Cl. Aucun signal dans la région de 1750–1600 cm-1 ne confirme l'absence du groupe céto dans la structure. Les fréquences centrales ont établi la présence d'alcool, de groupes fonctionnels chlorure et les données sont présentées dans le tableau 4. Pour DP-5, le spectre HRMS/MS et le mécanisme provisoire proposé pour les ions de fragmentation protonés sont capturés dans les Fig. 4 et S1.

L'étude de dégradation de l'ertugliflozine dans des conditions de stress a été examinée conformément aux directives de l'ICH. L'API a été soumis à des conditions de dégradation oxydative, acide, alcaline, neutre, photolytique et thermolytique. Le médicament était stable dans des conditions basiques, neutres, thermiques et photolytiques, et aucun produit de dégradation n'a été observé. Cependant, cinq produits de dégradation se sont formés dans des conditions d'hydrolyse acide et sous stress oxydatif. Ces dégradants sont développés en raison du réarrangement du cycle, qui est labile à l'hydrolyse acide (DP-1, DP-2, DP-3 et DP-4), et DP-5 a été formé en éliminant le groupe éthyle en présence de conditions de peroxyde. Tous les produits de dégradation ont été séparés et entièrement caractérisés à l'aide de diverses techniques analytiques telles que la RMN (expériences 1D et 2D) et les expériences HRMS/MS. Les données FT-IR ont donné un complément supplémentaire pour confirmer les structures. Les cinq PD sont des produits nouveaux et ne sont signalés dans aucune littérature. L'étude actuelle fournit l'interprétation structurelle complète de l'ertugliflozine et des 5 produits de dégradation à l'aide d'études HRMS, FTIR et 2D-NMR. Il rapporte également une méthode UHPLC-MS bien développée pour séparer tous les produits de dégradation avec une bonne résolution.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations complémentaires.

Ertugliflozine

Ingrédient pharmaceutique actif

Conseil international d'harmonisation

Co-transporteur sodium glucose 2

Chromatographie liquide ultra-haute performance-spectrométrie de masse

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Spectrométrie de masse haute résolution

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire bidimensionnelle

Détecteur quadripolaire unique

Détecteur à barrette de photodiodes

Ionisation par électrospray

Spectroscopie Corrélée Filtrée Double Quantique à Gradient

Spectroscopie de cohérence quantique unique hétéronucléaire à gradient

Spectroscopie de cohérence de liaisons multiples hétéronucléaires à gradient

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Sincères remerciements à Aragen Life Sciences Pvt. Ltd. Management et GITAM management pour le soutien et la mise à disposition des installations de laboratoire pour effectuer cette recherche.

Chimie de découverte analytique, Aragen Life Sciences Pvt. Ltd., IDA Nacharam, Hyderabad, 500076, Inde

Suresh Salakolusu, Muralidharan Kaliyaperumal, Umamaheshwar Puppala et Mahesh Ranga

Département de chimie, GITAM School of Science, GITAM Deemed to be University, Visakhapatnam, 530045, Andhra Pradesh, Inde

Suresh Salakolusu & Ganapavarapu Veera Raghava Sharma

Département de chimie, GITAM School of Science, GITAM Deemed to be University, Hyderabad, 502329, Telangana, Inde

Naresh Kumar Katari

École de chimie et de physique, Collège d'agriculture, d'ingénierie et de sciences, Westville Campus, Université du KwaZulu-Natal, P Bag X 54001, Durban, 4000, Afrique du Sud

Naresh Kumar Katari & Sreekantha Babu Jonnalagadda

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SS a effectué toutes les analyses expérimentales dans ce document de recherche, y compris la purification et l'analyse HRMS. NKK a participé à la conception du travail, effectué l'analyse statistique, rédigé le manuscrit et supervisé. GVRS a contribué à l'analyse théorique et a aidé à comparer les résultats des tests théoriques et expérimentaux. MK a aidé à la collecte de la littérature et à l'exécution des travaux. L'UP a participé à l'interprétation des produits de dégradation. MR a été pris en charge pour l'analyse RMN des produits de dégradation. SB Jonnalagadda a revu et édité le manuscrit. Nous autorisons la publication de l'article sans aucun conflit.

Correspondance à Naresh Kumar Katari ou Ganapavarapu Veera Raghava Sharma.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Salakolusu, S., Katari, NK, Sharma, GVR et al. Identification, isolement et caractérisation structurelle de nouveaux produits de dégradation forcée de l'ertugliflozine à l'aide de techniques analytiques avancées. Sci Rep 13, 9472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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Reçu : 15 janvier 2023

Accepté : 31 mai 2023

Publié: 10 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36289-9

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