Effets de l'acidification sur la nitrification et les émissions d'oxyde nitreux associées dans les eaux estuariennes et côtières

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1380 (2023) Citer cet article

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Dans le contexte d'un niveau croissant de dioxyde de carbone (CO2) atmosphérique, l'acidification des eaux estuariennes et côtières est fortement exacerbée par les apports de nutriments d'origine terrestre, les remontées d'eau côtières et les processus biogéochimiques complexes. Une meilleure compréhension de la façon dont les nitrifiants réagissent à l'intensification de l'acidification est donc cruciale pour prédire la réponse des écosystèmes estuariens et côtiers et leur contribution au changement climatique mondial. Ici, nous montrons que l'acidification peut réduire considérablement le taux de nitrification mais stimuler la génération de sous-produit d'oxyde nitreux (N2O) dans les eaux estuariennes et côtières. En faisant varier la concentration de CO2 et le pH indépendamment, un effet bénéfique attendu d'un CO2 élevé sur l'activité des nitrifiants (effet "CO2-fertilisation") est exclu sous acidification. Les données du métatranscriptome démontrent en outre que les nitrifiants pourraient réguler à la hausse de manière significative les expressions géniques associées à l'homéostasie du pH intracellulaire pour faire face au stress d'acidification. Cette étude met en évidence les fondements moléculaires des effets de l'acidification sur la nitrification et les émissions de gaz à effet de serre associées, et aide à prédire la réponse et l'évolution des écosystèmes estuariens et côtiers face au changement climatique et aux activités humaines.

Le dioxyde de carbone (CO2) dans l'atmosphère a augmenté en raison d'activités humaines intensives telles que la combustion de combustibles fossiles, la production de ciment, la déforestation et d'autres changements d'affectation des terres1. À l'échelle mondiale, la concentration atmosphérique moyenne de CO2 a maintenant atteint 413,2 ppm et devrait dépasser 800 ppm d'ici la fin du 21e siècle2,3. Environ 40 % du CO2 émis pendant l'ère industrielle a été absorbé par les océans4, entraînant par conséquent une réduction d'environ 0,1 unité de pH dans l'eau de mer de surface5,6. Une nouvelle baisse de 0,2 à 0,3 unités de pH est estimée à la fin de ce siècle, avec de graves conséquences attendues pour les organismes et les écosystèmes sensibles6,7,8.

Les écosystèmes estuariens et côtiers sont des régions dynamiques sous l'interaction des rivières, des terres et des océans9, qui peuvent fournir des services écosystémiques vitaux pour le bien-être humain10. Dans le contexte d'une augmentation du niveau de CO2 atmosphérique, les eaux estuariennes et côtières souffrent cependant d'une acidification plus aiguë que les océans ouverts, sous les effets synergiques des apports de nutriments d'origine terrestre, de l'upwelling côtier et des processus biogéochimiques complexes (Fig. 1 supplémentaire)11,12. L'une des plus grandes menaces pour les écosystèmes estuariens et côtiers dans le monde est l'apport excessif de nutriments anthropiques des bassins versants10. La production de phytoplancton induite par l'eutrophisation peut entraîner un taux de respiration élevé dans les eaux de fond où la matière dérivée des algues se dépose, ce qui peut entraîner une forte production de CO213. L'acidification des eaux estuariennes et côtières peut donc être fortement intensifiée par l'intrusion épisodique d'eau de remontée d'eau à forte teneur en CO211,13,14, qui peut nuire aux processus biologiques et au fonctionnement des écosystèmes estuariens et côtiers15,16,17,18,19,20,21.

La nitrification est un processus critique pour l'équilibre des pools d'azote réduit et oxydé, reliant la minéralisation aux voies d'élimination de l'azote de la dénitrification et de l'oxydation anaérobie de l'ammonium22. Il joue ainsi un rôle crucial dans le cycle global de l'azote, en particulier dans les écosystèmes aquatiques eutrophes. En raison de la croissance lente des nitrifiants et de leur grande sensibilité aux perturbations environnementales23, la nitrification devrait être perturbée par l'acidification aquatique. Une complication dans la réponse des nitrifiants à l'acidification est que l'augmentation de la pression partielle de CO2 (pCO2) et la diminution du pH peuvent avoir des effets opposés. Une condition de pCO2 plus élevée devrait bénéficier à la nitrification, car une source de carbone accrue peut favoriser la croissance des nitrifiants chimioautotrophes (fertilisation au CO2)24,25,26,27. En revanche, la diminution concomitante du pH peut déplacer l'équilibre entre l'ammoniac (NH3) et l'ammonium (NH4+) vers une concentration plus faible de substrat NH3 disponible pour les oxydants d'ammoniac et ainsi inhiber la nitrification25,28,29. La réponse des nitrifiants dépend donc fortement de l'équilibre de ces effets potentiels positifs et négatifs. Cependant, on sait peu de choses sur les effets des niveaux projetés d'acidification aquatique sur les métabolismes des nitrifiants et les mécanismes sous-jacents.

La nitrification est également une voie importante pour la production de gaz à effet de serre de protoxyde d'azote (N2O)30,31,32,33, qui a un forçage radiatif >300 fois plus fort par mole que le CO2 et peut réagir avec l'ozone dans la stratosphère34. Le N2O peut être produit par voie enzymatique par des bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) via la conversion de l'hydroxylamine (NH2OH) en N2O35,36, ou via la dénitrification nitrifiante [une réduction séquentielle du nitrite (NO2−) en oxyde nitrique (NO) et N2O]35. Récemment, la conversion biotique de NH2OH en N2O par AOB via le cytochrome P460 a également été caractérisée36. En revanche, l'émission de N2O associée à l'oxydation de NH3 par les archées oxydant l'ammoniac (AOA) résulterait principalement de réactions abiotiques entre NH2OH et NO2− ou NO32,37,38. Des études antérieures ont suggéré que l'AOA produisait des rendements de N2O inférieurs à ceux de l'AOB lors de l'oxydation aérobie du NH337,39. De plus, il a été documenté que les oxydants complets d'ammoniac (comammox) présentent un rendement en N2O inférieur à celui de l'AOB, car le N2O provient plutôt de la conversion abiotique de NH2OH par les bactéries comammox40,41. Cependant, on ne sait pas encore comment la production de N2O nitrifiant réagira à l'acidification aquatique.

Ici, nous examinons comment l'acidification aquatique affecte le taux de nitrification et les émissions de N2O associées dans l'estuaire du Yangtze et les eaux côtières adjacentes. Des expériences de manipulation sont également menées pour découpler les effets individuels d'un pCO2 élevé et d'un pH réduit. Les métatranscriptomes sont ensuite analysés pour élucider la réponse métabolique des microbes nitrifiants en suivant l'expression des gènes sensibles à l'acidification. Cette recherche fournit des informations sur les interactions mécanistes entre l'acidification et la nitrification, et aide à prédire l'évolution écologique future des écosystèmes estuariens et côtiers.

Différents niveaux d'acidification (pH réduit de 0,10 à 1,05) ont été obtenus grâce à des échantillons d'eau bouillonnante prélevés sur six sites représentatifs (Yz1 à Yz6) le long de l'estuaire du Yangtze et des eaux côtières adjacentes avec différents mélanges gazeux air:CO2 (Fig. 1, Tableaux supplémentaires 1 et 2). Les taux de nitrification sur ces sites ont montré une réponse identique à l'acidification : tous ont remarquablement diminué lorsque le pH a été réduit, indépendamment d'un effet bénéfique potentiel d'un CO2 élevé (Fig. 2 supplémentaire). Une diminution des taux de nitrification (5,8 à 18,1 %) a été détectée sous la réduction du pH, même de 7,92 à 8,15 à 7,80 à 8,04 (pCO2 augmenté de 122 à 172 μatm) (P < 0,05). Les taux de nitrification ont diminué d'environ 11,1 à 34,1 % lorsque la pCO2 a doublé (P < 0,05). La diminution des taux de nitrification était fortement corrélée à la réduction du pH de l'eau (P <0, 05), sur la base des courbes acidification-réponse construites (Fig. 2a). Les taux de nitrification diminueraient d'environ 7,7 à 25,0 % sous une réduction moyenne d'environ 0,21 unités de pH qui a été observée dans les eaux estuariennes et côtières du monde entier au cours des dernières décennies (Fig. 1 supplémentaire). Cet effet d'inhibition de l'acidification sur le taux de nitrification est cohérent avec ce qui a été précédemment observé dans les océans ouverts28,42. Alors qu'il a été signalé que le taux de nitrification augmentait le long d'un gradient naturel décroissant de pH dans la baie de Narragansett43, cela était probablement dû à une combinaison de conditions biogéochimiques plutôt qu'à l'effet de l'acidification seule.

Les stations sont signalées par des étoiles rouges.

a Taux de nitrification. Les données montrent les changements en pourcentage des taux de nitrification dans les traitements acidifiés par rapport au témoin ambiant. Pour toutes les lignes, P < 0,05. b Taux de production de N2O. Les données montrent les changements en pourcentage des taux de production de N2O dans les traitements acidifiés par rapport au témoin ambiant. Pour toutes les lignes, P < 0,05. Les barres d'erreur représentent SD (n = 3 échantillons biologiquement indépendants). Le ΔpH correspond à la diminution entre le pH de l'eau avant et après acidification. La courbe d'ajustement a été obtenue par la méthode d'ajustement polynomial. Les équations et les valeurs P pour les courbes ajustées sont données dans le tableau supplémentaire 3. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

L'inhibition du taux de nitrification par acidification avait tendance à être plus faible dans les eaux de l'estuaire supérieur où les AOB étaient les oxydants d'ammoniac dominants que dans les régions côtières adjacentes où les communautés oxydant l'ammoniac étaient dominées par l'AOA (Fig. 2a et Fig. 3 supplémentaire). Outre l'hétérogénéité des communautés microbiennes nitrifiantes, cette variabilité de l'influence de l'acidification sur le taux de nitrification peut provenir de multiples facteurs biogéochimiques43. En particulier, les concentrations relativement plus élevées de NH4+ dans les estuaires supérieurs peuvent atténuer les effets inhibiteurs sur l'oxydation de l'ammoniac causée par l'acidification (tableau supplémentaire 1). De manière constante, l'inhibition mesurée du taux de nitrification par acidification dans les eaux estuariennes et côtières était généralement inférieure à celle des mers oligotrophes où les taux de nitrification ont diminué de 3 à 44 % en réponse à une diminution de 0,1 unité de pH28,42. En effet, la concentration de NH4 + était négativement corrélée à l'effet d'inhibition de l'acidification sur le taux de nitrification dans différents habitats allant de l'estuaire à l'océan ouvert (P <0, 05) 28, 42, 44 (Fig. 4 supplémentaire). Néanmoins, compte tenu de l'aggravation plus rapide et continue de l'acidification dans les eaux estuariennes et côtières en raison des effets synergiques de l'eutrophisation induite par l'activité humaine et du niveau élevé de CO2 atmosphérique11, sa perturbation des taux de nitrification pourrait avoir des conséquences profondes sur les processus écosystémiques estuariens et côtiers.

Sur la base de la réponse des taux de nitrification, réf. 28 ont émis l'hypothèse que la diminution des taux de nitrification résultant de l'acidification des océans pourrait réduire considérablement la production de N2O en haute mer. L'impact de l'acidification aquatique sur la production de N2O peut cependant être dissocié de son impact sur les taux de nitrification45. Par exemple, réf. 42 ont récemment rapporté que lorsque le pH de l'eau de mer dans l'ouest du Pacifique Nord était réduit, la production de N2O augmentait de manière significative tandis que les taux de nitrification restaient stables ou même diminuaient. Cependant, dans leur travail, l'acidification a été manipulée en ajoutant de l'acide fort (HCl). Bien que l'ajout de HCl puisse élever le pCO2 et réduire le pH, il modifie également l'alcalinité et entraîne des paramètres de carbonate différents par rapport à ceux attendus à l'avenir, c'est-à-dire que le carbone inorganique dissous (CID) augmente sous l'acidification aquatique naturelle au lieu de rester inchangé46. De plus, les communautés nitrifiantes dans divers habitats aquatiques peuvent réagir différemment à l'acidification, car les mécanismes de production de N2O diffèrent entre les différents organismes nitrifiants32,38,40. Par conséquent, la réponse de la production de N2O pendant la nitrification à l'acidification aquatique dans les eaux estuariennes et côtières doit être évaluée.

Grâce à l'aération avec de l'air stérile à différents niveaux de CO247, qui peut mieux imiter l'acidification aquatique en cours, nous avons constaté que les taux de production de N2O sur tous les sites d'échantillonnage étaient considérablement améliorés par l'acidification (Fig. 5 supplémentaire). Même sous une baisse de pH d'environ 0,1 unité (7,92–8,15 à 7,80–8,04), une promotion significative de la production de N2O (8,4–23,1 %) a été observée à la fin de l'incubation (P < 0,05). Des courbes acidification-réponse ont été construites entre la baisse du pH et l'émission de N2O, montrant une augmentation significative des taux de production de N2O ainsi que l'augmentation des niveaux d'acidification (P <0, 05) (Fig. 2b). Sous une réduction moyenne d'environ 0,21 unité de pH détectée dans les régions estuariennes et côtières du monde entier, les taux de production de N2O pendant la nitrification pourraient augmenter d'environ 9,5 à 27,5 % (Fig. 2b). Ces résultats appuient notre hypothèse selon laquelle, à l'instar d'autres perturbations environnementales telles qu'une faible exposition à l'oxygène et aux substances toxiques23,42,48, l'acidification peut augmenter la production de N2O dans les eaux estuariennes et côtières, que l'AOB ou l'AOA dominent. Par conséquent, bien que les mécanismes de production de N2O diffèrent entre les différents organismes nitrifiants32,38,40, leur taux de production de N2O pourrait augmenter en cas de réduction du pH. L'augmentation de la production de N2O dans des conditions acidifiées dans les eaux estuariennes et côtières est cohérente avec celle de l'ouest du Pacifique Nord42. Cependant, la réf. 44 ont documenté l'inhibition de la production de N2O par l'acidification des océans dans les eaux froides tempérées et polaires. En supposant que la nitrification est la principale voie de production de N2O dans leur étude, la réponse de la production de N2O à l'acidification serait différente dans les mers polaires. Bien que les dénitrifiants hétérotrophes puissent également contribuer à la production de N2O, leur contribution peut être insignifiante, car les signatures isotopiques naturelles du N2O ont montré que la voie de réduction du NO2− (y compris la dénitrification nitrifiante et la dénitrification hétérotrophe) ne contribuait qu'à hauteur de 0 à 13,3 % du N2O libéré (tableau supplémentaire 4). De plus, les échantillons de tous les sites d'étude étaient bien oxygénés [oxygène dissous (OD) : 8,30–9,86 mg L−1 ; Tableau supplémentaire 1] et est resté à des niveaux élevés d'OD pendant l'incubation (tableau supplémentaire 2), ce qui était peu susceptible de se produire pour la dénitrification hétérotrophe. Des études antérieures ont rapporté que lorsque la concentration en OD est supérieure à 0,06 mg L−1, la production de N2O par dénitrification hétérotrophe est complètement inhibée49. Par conséquent, la contribution des bactéries dénitrifiantes à la production de N2O devrait être négligeable. Cette étude démontre que la production de N2O pendant la nitrification des nitrifiants à dominance AOB et à dominance AOA peut être stimulée par l'acidification, ce qui est une étape importante pour évaluer l'impact de l'acidification en cours sur les émissions de N2O dans les écosystèmes estuariens et côtiers complexes et dynamiques. Si nos résultats sont représentatifs et que les nitrifiants contribuent à la moitié des émissions mondiales de N2O estuarien et côtier50,51 (Fig. 6 supplémentaire et Tableau supplémentaire 5), les émissions de N2O dérivées de la nitrification dans ces écosystèmes augmenteraient de 0,05 à 0,15 Tg N2O-N an-1 en réponse à une diminution moyenne de 0,21 unités de pH (Texte supplémentaire 1), représentant 0,7 à 2,2 % du total. émissions anthropiques de N2O dans le monde (6,9 Tg N2O-N an−1)52.

Nos résultats ont montré que l'acidification peut inhiber les taux de nitrification mais augmenter les émissions de N2O dans les eaux estuariennes et côtières (Fig. 2). Cependant, l'augmentation de pCO2 et la diminution du pH peuvent avoir des effets opposés sur les nitrifiants. Pour distinguer les effets individuels d'un pCO2 élevé et d'un pH réduit, une série de systèmes de microcosmes ouverts à flux continu ont été construits. La chimie du carbonate a été manipulée en faisant bouillir régulièrement des échantillons d'eau collectés du site Yz3 avec de l'air ajusté au CO2 (400 μatm et 800 μatm) tout en ajustant le pH (7,8 et 8,1) avec une solution stérile d'acide ou de base selon un détecteur de pH en temps réel (Fig. 7 supplémentaire). Les états d'équilibre ont été atteints dans quatre scénarios [faible pCO2 (400 μatm) et pH élevé (8,1) ; faible pCO2 (400 μatm) et faible pH (7,8) ; pCO2 élevé (800 μatm) et pH bas (7,8) ; pCO2 élevé (800 μatm) et pH élevé (8,1)] et est resté stable pendant la période d'incubation (tableau supplémentaire 6). Les résultats ont montré que les taux de nitrification diminuaient de manière significative à un pH faible, indépendamment du niveau de pCO2 (Fig. 3a), démontrant les effets négatifs d'un pH réduit sur les taux de nitrification. Cependant, l'effet d'une pCO2 élevée, qui devrait bénéficier à la nitrification, semble dépendre du pH (Fig. 3a). Lorsque le pH était maintenu à la valeur ambiante de 8,1, un effet évident de "fertilisation par le CO2" a été observé lorsque les taux de nitrification augmentaient à un pCO2 élevé (Fig. 3a). En revanche, dans des conditions acidifiées (pH 7,8), une pCO2 élevée a provoqué une diminution inattendue des taux de nitrification (Fig. 3a). Ce modèle suggère que, lorsque les processus métaboliques des nitrifiants apparentés sont affectés par un pH réduit, l'augmentation de la pCO2 devient un facteur de stress additif. Ces résultats contrastent avec l'observation des cyanobactéries fixatrices de N2, qui peuvent bénéficier d'un pCO2 élevé dans des conditions de pH réduit53.

a Taux de nitrification. b Taux de production de N2O pendant la nitrification. Quatre scénarios ont été construits : le contrôle ambiant (400 μatm/pH 8,1, barres bleues pleines), le groupe acidifié (800 μatm/pH 7,8, barres rouges pleines), la réduction du pH uniquement (400 μatm/pH 7,8, barres ouvertes rouges) et l'augmentation du pCO2 uniquement (800 μatm/pH 8,1, barres bleues ouvertes). Des lettres minuscules différentes (a, b, c et d) au-dessus des colonnes indiquent des différences significatives entre les quatre scénarios (P < 0,05). Les barres d'erreur représentent SD (n = 3 échantillons biologiquement indépendants), et les points sont les points de données correspondants des répétitions. Les différences significatives ont été déterminées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La production de N2O pendant la nitrification a été favorisée dans des conditions acidifiées (Fig. 2b), à la fois par le pH réduit et le pCO2 élevé (Fig. 3b). La promotion de la production de N2O sous un pCO2 élevé tout en maintenant le pH ambiant était inattendue (Fig. 3b) car cette condition était bénéfique pour les nitrifiants (fertilisation au CO2 ; Fig. 3a). Il est possible que la production de sous-produit N2O puisse augmenter avec l'augmentation des taux de nitrification. Cependant, cette possibilité ne peut pas entièrement expliquer l'émission accrue de N2O dans les conditions d'une seule élévation du pCO2 (pCO2 800 μatm/pH 8,1), car la promotion du taux de production de N2O était significativement plus élevée que le taux de nitrification (Fig. 3). Dans des conditions naturelles acidifiées (une élévation de la pCO2 concomitante à une réduction du pH), la plus forte promotion de l'émission de N2O peut être attendue lorsque les effets de la réduction du pH et de l'élévation de la pCO2 sont combinés (Fig. 3b). Il s'agit de la première tentative de découpler les effets individuels d'une pCO2 élevée et d'un pH réduit sur le taux de nitrification et les émissions de N2O associées dans des environnements aquatiques acidifiés, fournissant des informations sur le mécanisme sous-jacent de l'acidification aquatique affectant les nitrifiants. Leurs effets individuels ont été distingués avec succès sur la base de nos systèmes d'incubation à débit d'air continu et de pH automatique. Il a été précédemment émis l'hypothèse que l'augmentation des niveaux de pCO2 peut avoir un effet positif sur l'activité des nitrifiants chimioautotrophes54. En revanche, dans des conditions acidifiées, une pCO2 élevée peut inhiber davantage le taux de nitrification et favoriser l'émission indésirable de N2O sous-produit. Par conséquent, les effets négatifs de l'acidification aquatique sur les transformations microbiennes de l'azote et leur rétroaction sur le changement climatique mondial sont probablement plus intenses qu'on ne le pensait auparavant (Fig. 8 supplémentaire).

En tant que réponse moléculaire importante au stress d'acidification, les nitrifiants peuvent ajuster l'expression des gènes par des réseaux de signalisation intracellulaires, ce qui peut être davantage reflété par un taux de nitrification réduit et une production accrue de N2O. Cependant, la réponse transcriptionnelle des communautés nitrifiantes à l'acidification aquatique reste inconnue. Le séquençage du métatranscriptome peut être utilisé pour interroger l'expression différentielle de gènes impliqués dans le métabolisme physiologique des communautés nitrifiantes dans des conditions acidifiées23. Cependant, les tentatives précédentes d'acquisition de métatranscriptomes basées sur les expériences d'acidification à court terme ont échoué, car il n'y avait pas assez d'ARNm avec une bonne intégrité et pureté, ce qui pourrait être dû à l'extrême instabilité de l'ARNm et à la complexité des échantillons environnementaux23. Plus important encore, les nitrifiants ne représentent qu'une petite fraction des communautés microbiennes complexes dans les eaux estuariennes et côtières (<5%; Fig. 9 supplémentaire), il est donc difficile d'extraire suffisamment de transcrits nitrifiants pour révéler pleinement le métabolisme physiologique des nitrifiants. Ainsi, une série de simulateurs environnementaux à flux continu avec des prélèvements d'eau du site Yz3 ont été mis en place pour mimer l'acidification à long terme et enrichir les nitrificateurs. Le pH et le pCO2 dans les témoins ambiants ont été maintenus à environ 8,1 et 400 μatm, respectivement, alors qu'ils ont été stabilisés à environ 7,8 et 800 μatm, respectivement, dans les traitements acidifiés. Après environ 25 jours, les simulateurs fonctionnant en continu ont présenté des réactions de nitrification stables (Fig. 10 supplémentaire) et une dominance des communautés nitrifiantes (représentant respectivement 44, 6% et 45, 5% dans les contrôles ambiants et les traitements acidifiés) (Fig. 11, 12 supplémentaires). Les bactéries nitrifiantes in situ se sont simultanément enrichies et les membres originels de l'environnement (Nitrosomonas et Nitrospira) sont restés dominants. Cependant, le nombre de cellules d'AOA n'a pas été considérablement augmenté dans les enrichissements nitrifiants, et la culture d'AOA a donc été poursuivie avec de la streptomycine pour inhiber les bactéries nitrifiantes. Après 50 jours d'incubation, l'abondance relative de l'AOA est passée de 1,1% à 11,2%, alors que les bactéries nitrifiantes étaient indétectables (Fig. 13 supplémentaire). Pour ces cultures d'enrichissement nitrifiant, des taux de nitrification réduits et des émissions de N2O stimulées ont été observés dans les traitements acidifiés (Figs. 14, 15 supplémentaires), un schéma cohérent avec celui des échantillons d'eau sur le terrain. Bien que la manipulation de l'enrichissement modifie les communautés microbiennes environnementales d'origine, les enrichissements nitrifiants sont des représentants pour étudier la réponse transcriptionnelle des nitrifiants à l'acidification dans les eaux estuariennes et côtières complexes.

Selon les analyses métatranscriptomiques (tableau supplémentaire 7), l'acidification induite par le CO2 peut affecter de manière significative les métabolismes physiologiques des nitrifiants au niveau transcriptionnel, car les gènes impliqués dans les transformations de l'azote, l'homéostasie du pH cytosolique, la génération d'énergie et la fixation du CO2 étaient tous fortement régulés par l'acidification (Figs. 4a – c, 5a – c). L'expression de la sous-unité potentiellement active du gène de l'ammoniac monooxygénase (amoA) d'AOB était régulée à la baisse de 66% pour les traitements acidifiés (Fig. 4a). La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) a également démontré que l'expression du gène bactérien amoA était significativement régulée à la baisse dans des conditions acidifiées (P <0, 01; tableau supplémentaire 9). De manière constante, les expressions de l'amoB bactérienne (sous-unité B de l'ammoniac monooxygénase, également suggérée comme sous-unité catalytique56) et de l'amoC (sous-unité C de l'ammoniac monooxygénase) ont diminué de 68 et 69%, respectivement, après acidification (Fig. 4c). De plus, l'expression du gène de l'hydroxylamine déshydrogénase (hao) a été régulée à la baisse de 61% (P <0, 01), tandis que les expressions des gènes de nitrite oxydoréductase nxrA et nxrB ont été réduites de 76 et 61% (P <0, 01), respectivement, dans des conditions acidifiées (Fig. 4c et tableau supplémentaire 9). Sur la base des données de transcription de l'AOA, l'expression de l'amoA archéale était également régulée à la baisse (24%) dans des conditions acidifiées (P <0, 05) (Fig. 5a et tableau supplémentaire 9). De plus, les transcrits de l'amoC archéen ont été régulés à la baisse de 43%, tandis que l'expression de l'amoB archéen est restée inchangée sous acidification (Fig. 5c). Dans l'ensemble, les transcrits de gènes fonctionnels impliqués dans l'oxydation par étapes de NH3 en nitrate (NO3−) étaient généralement régulés à la baisse dans des conditions acidifiées, ce qui correspond à la réduction des taux de nitrification (Fig. 2a).

un modèle schématique illustrant les effets de l'acidification sur l'expression des gènes impliqués dans l'oxydation par étapes de NH3 (NH3 → NH2OH → NO → NO2− → NO3−), la production de N2O, la génération d'énergie et l'homéostasie du pH cytosolique des bactéries nitrifiantes. La membrane est brisée par une ligne pointillée, car l'oxydation des nitrites ne se produit pas souvent dans le même organisme avec l'oxydation de l'ammoniac, à l'exception du comammox Nitrospira récemment découvert. Le changement de pli (FC) dans l'expression relative des gènes a été calculé en comparant les échantillons acidifiés au contrôle ambiant. Les chiffres romains font référence au complexe enzymatique I (NADH déshydrogénase), au complexe III (complexe cytochrome bc1), au complexe IV (cytochrome c oxydase) et au complexe V (ATP synthase) dans la chaîne respiratoire. Les flèches bleues pointillées montrent le mouvement des électrons. E, enzyme inconnue. b Effets de l'acidification sur l'expression des gènes impliqués dans la fixation du CO2 par les cycles de Calvin et de l'acide tricarboxylique réducteur (rTCA). Les couleurs au centre des pictogrammes de protéines indiquent l'étendue de la régulation à la hausse ou à la baisse des transcrits de gènes codant pour ces protéines. Les couleurs à la périphérie des pictogrammes de protéines correspondent aux couleurs des barres en (c). c FC des transcrits codant pour les protéines montrés en (a) et (b). Les définitions des abréviations sont présentées dans le tableau supplémentaire 8. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

un modèle schématique illustrant les effets de l'acidification sur l'expression des gènes impliqués dans l'oxydation du NH3, la production de N2O, la génération d'énergie et l'homéostasie du pH cytosolique de l'AOA. Le changement de pli (FC) dans l'expression relative des gènes a été calculé en comparant les échantillons acidifiés au contrôle ambiant. Les chiffres romains font référence au complexe enzymatique I (NADH déshydrogénase), au complexe III (b-pcy), au complexe IV (pcy-aa3) et au complexe V (ATP synthase) dans la chaîne respiratoire. Les flèches bleues pointillées montrent le mouvement des électrons. b Effets de l'acidification sur l'expression des gènes impliqués dans le cycle 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate. Les couleurs au centre des pictogrammes de protéines indiquent l'étendue de la régulation à la hausse ou à la baisse des transcrits de gènes codant pour ces protéines. Les couleurs à la périphérie des pictogrammes de protéines correspondent aux couleurs des barres en (c). c FC des transcrits codant pour les protéines montrés en (a) et (b). Les définitions des abréviations sont présentées dans le tableau supplémentaire 8. Les données source sont fournies sous forme de fichier de données source.

En revanche, les transcrits de gènes codant pour l'oxyde nitrique réductase bactérienne nitrifiante (formant N2O, nor) ont été régulés positivement par l'acidification (Fig. 4a). Les expressions des gènes norB, norC, norD et norQ d'AOB ont été régulées à la hausse de 2, 5, 16, 2, 0, 7 et 0, 2 fois, respectivement (figure 4c et tableau supplémentaire 9). Ces résultats fournissent des preuves moléculaires de la stimulation observée de l'émission de N2O dans des conditions acidifiées. Bien que d'autres enzymes aient pu également contribuer à la nitrification des émissions bactériennes de N2O, comme le cytochrome c554 (codé par cycA)57, le cytochrome c'-β (codé par cytS)58 et le cytochrome P46036, les transcrits de ces protéines n'ont pas été observés dans cette étude. Contrairement à l'expression considérablement régulée à la hausse des gènes de l'oxyde nitrique réductase, les transcrits de la nitrite réductase (formant NO, nirK) des bactéries nitrifiantes ont été régulés à la baisse de 43% dans les traitements acidifiés par rapport au témoin ambiant (P <0, 05) (Fig. 4c et tableau supplémentaire 9), ce qui implique que la réduction de NO2− par les bactéries nitrifiantes aurait pu être inhibée par l'acidification. Par conséquent, l'émission accrue de N2O dans des conditions acidifiées ne provenait pas de la voie de dénitrification des nitrifiants bactériens. Bien qu'il ait été suggéré que la réaction hybride abiotique était la principale source de rendement de N2O archéen32,37,38, des enzymes présumées, notamment l'hydroxylamine oxydoréductase de cuivre (Cu-HAO) et la nitroxyl oxydoréductase putative, ont été supposées être impliquées dans la production de N2O d'AOA59. Cependant, les transcrits de ces protéines présumées n'ont pas été observés (Fig. 5a). De plus, la nitrite réductase de cuivre archaéenne (nirK) peut fonctionner comme HAO de type bactérie pour oxyder NH2OH en N2O, ou peut être impliquée dans la production de N2O d'AOA via la dénitrification nitrifiante59. Néanmoins, la réponse transcriptionnelle du gène archaea nirK peut ne pas être la principale cause de l'augmentation des émissions de N2O sous acidification, car l'expression de l'archaea nirK était légèrement régulée à la baisse (Fig. 5c). Au contraire, les transcrits du gène norQ présomptif de l'oxyde nitrique réductase archéen ont été régulés à la hausse de 0, 2 fois dans des conditions acidifiées (Fig. 5c). Considérant que, en raison de la compréhension limitée des voies de production de N2O induites par l'AOA, le mécanisme moléculaire de l'élévation de l'émission de N2O induite par l'AOA sous acidification doit être davantage élucidé.

Il a été rapporté que le pH intracellulaire de la cyanobactérie diminuait avec le pH de l'eau dans des conditions acidifiées53. Si le cas se produit pour les nitrifiants, ils peuvent avoir besoin de générer plus de force motrice du proton (PMF), ce qui est nécessaire pour la synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP)60. Cependant, les transcrits de gènes impliqués dans les enzymes liées à la membrane de translocation des protons des bactéries nitrifiantes enrichies étaient régulés à la baisse dans les traitements acidifiés (Log2FC <-1) (Fig. 4a). Les transcrits bactériens nitrifiants du gène NADH-quinone oxydoréductase (nuo) du complexe I, du gène ubiquinol-cytochrome c réductase (pet) du complexe III et du gène cytochrome c oxydase du complexe IV ont été régulés à la baisse de 60%, 57% et 61%, respectivement, dans des conditions acidifiées (Fig. 4c). Ainsi, sur la base de ces données, nous ne pouvons pas distinguer si le pH cytoplasmique des bactéries nitrifiantes a été réduit sous le degré d'acidification imposé. Néanmoins, un aperçu important a été obtenu en sondant les transcrits de gènes codant pour les adénosine triphosphatases (ATPases) productrices d'énergie. La famille des ATPases bactériennes comprend des complexes protéiques liés à la membrane responsables soit de la synthèse de l'ATP à l'aide d'un PMF transmembranaire, soit de l'établissement du PMF à l'aide de l'énergie libérée par l'hydrolyse de l'ATP61,62. Sur la base des données métatranscriptomiques, les transcrits de gènes codant pour les ATPases bactériennes de type V, fonctionnant comme des pompes à protons dépendantes de l'ATP, ont été régulés positivement (jusqu'à 11, 5 fois plus) dans des conditions acidifiées (Fig. 4c). Ce résultat suggère un besoin croissant de bactéries nitrifiantes pour pomper les protons cytoplasmiques afin de maintenir l'homéostasie du pH et le gradient H+ sous une réduction d'environ 0,3 unités de pH. De même, les transcrits du gène nuo archéen du complexe I, du gène cox de la cytochrome c oxydase du complexe IV et des gènes atp ATPase de type V archéens ont été significativement régulés à la hausse (Log2FC> 0, 5; Fig. 5a), montrant que le pH intracellulaire de l'AOA peut également avoir diminué avec le pH de l'eau.

Dans des conditions acidifiées, une augmentation de la demande d'énergie pour la translocation des substrats à travers les membranes pourrait se produire, car les transcrits de gènes codant pour les transporteurs de cassettes de liaison à l'ATP correspondants étaient régulés à la hausse (avec une régulation à la hausse maximale de 11 fois, Figs. 4c et 5c). Ces résultats suggèrent qu'une plus grande partie de l'énergie dérivée de l'oxydation du NH3 ou du NO2− pourrait avoir été allouée pour faire face au stress d'acidification, par exemple pour maintenir l'homéostasie du pH cytosolique et les transports de substrats. Cependant, la production totale d'ATP a probablement été réduite, car les taux de nitrification ont été significativement inhibés par l'acidification. De plus, les transcrits de gènes codant pour les ATPases bactériennes de type F, qui fonctionnent comme des ATP synthases pilotées par PMF, ont été régulés à la baisse par acidification (avec une réduction moyenne de 63%, Fig. 4c). Néanmoins, l'expression des gènes associés au mécanisme de concentration du carbone qui sature l'enzyme de carboxylation, la ribulose bisphosphate carboxylase oxydase (Rubisco), était régulée à la baisse dans des conditions acidifiées (Log2FC < -1 ; Fig. 4a), suggérant une réduction des besoins énergétiques pour l'enrichissement en CO263 (Texte supplémentaire 2). Ce mécanisme de régulation peut expliquer l'effet de "fertilisation par le CO2" observé sous un pCO2 élevé mais sous un pH ambiant (800 μatm/pH 8,1) (Fig. 3a), car plus d'énergie a probablement été économisée et réaffectée à d'autres processus cellulaires. Cependant, l'énergie économisée grâce à une source de carbone élevée semblait être mineure par rapport aux perturbations causées par l'acidification, car des effets significativement négatifs ont été observés dans des conditions acidifiées (800 μatm/pH 7,8) (Fig. 3a). Collectivement, ces résultats suggèrent que l'acidification peut entraîner une baisse de la production d'ATP et une réaffectation de cette énergie pour soutenir le maintien des cellules plutôt que pour alimenter la croissance chimioautotrophique. En effet, le taux de croissance des bactéries nitrifiantes dominantes a été réduit lors des traitements acidifiés (réduction d'environ 25% et 27% pour Nitrosomonas et Nitrospira, respectivement) (Fig. 16a, b supplémentaires). D'autres preuves ont été observées au niveau de la transcription, car les transcrits de gènes impliqués dans la fixation du CO2 [cycle de Calvin pour Nitrosomonas et cycle réducteur de l'acide tricarboxylique pour Nitrospira] étaient omniprésents sous-régulés (Texte supplémentaire 3, Fig. 4b, c)25,27. Cependant, les transcrits de gènes impliqués dans la voie de fixation du carbone 3-hydroxypropionate / 4-hydroxybutyrate de l'AOA, qui est plus énergétiquement favorable 24, 26, étaient généralement régulés à la hausse dans des conditions acidifiées (Fig. 5b, c). Conformément à ces résultats, une abondance relativement plus élevée d'AOA a été détectée dans les traitements acidifiés (P <0, 05) (Fig. 16c supplémentaire), principalement en raison de la croissance chimioautotrophe de Nitrosopumilus (le genre AOA dominant) dont l'abondance relative a également augmenté dans des conditions acidifiées ( P <0, 05) (Fig. 6a). Ainsi, l'acidification aquatique pourrait modifier la communauté des oxydants d'ammoniac vers un rapport croissant d'AOA sur AOB. Cette variation pourrait également être causée par une affinité NH3 plus élevée de l'AOA22,64 et la disponibilité réduite de NH3 dans des conditions acidifiées25. Cependant, la réf. 44 ont rapporté que la composition de l'assemblage AOA n'était pas sensible à l'acidification des océans, peut-être parce que la période d'incubation (moins d'une semaine) dans leur étude n'était pas assez longue pour provoquer un renouvellement significatif de l'assemblage.

a Abondance relative de microbes nitrifiants basée sur le séquençage du gène de l'ARNr 16S avec des amorces universelles capables de détecter à la fois les bactéries et les archées dans les mêmes bibliothèques de séquençage. Le graphique inséré montre l'abondance relative des archées oxydant l'ammoniac (Nitrosopumilus et Nitrososphaera). Un astérisque simple indique une différence significative à P < 0,05, tandis que le double astérisque indique une différence significative à P < 0,01. La barre d'erreur représente SD (n = 3 échantillons biologiquement indépendants), et les points sont les points de données correspondants des répliques. b La proportion de transcrits clés du gène nitrifiant du comammox sur la base des données de séquençage du métatranscriptome. Les lignes horizontales dans les encadrés indiquent le milieu, les étoiles représentent la moyenne. Les cases donnent les 25e et 75e centiles, les moustaches indiquent la plage du 5e au 95e centile et les courbes montrent la distribution des valeurs. Un seul astérisque indique une différence significative à P < 0,05 (n = 6 gènes). Les différences significatives ont été déterminées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

De plus, les communautés de bactéries nitrifiantes ont été affectées par l'acidification (Fig. 6a). L'abondance relative de Nitrosomonas (l'AOB dominante) a diminué dans les traitements acidifiés (P < 0,05), tandis que celle de Nitrospira [la bactérie dominante oxydant les nitrites (NOB), y compris le comammox] a augmenté (P < 0,05). Ce rapport global accru de Nitrospira par rapport aux oxydants d'ammoniac connus indique une proportion croissante de comammox dans des conditions acidifiées. En effet, l'abondance du gène comammox amoA était plus élevée dans les traitements acidifiés (P <0, 05) (Fig. 16d supplémentaire). De plus, sur la base des données du métatranscriptome, des transcrits de gènes comammox plus élevés ont été détectés dans les traitements acidifiés (0, 78 à 11, 59% du total des transcrits de gènes obtenus impliqués dans l'oxydation par étapes de NH3 en NO3-) par rapport au témoin ambiant (seulement 0, 03 à 0, 89%, P <0, 05) (Fig. 6b et Fig. 17 supplémentaire). Fait intéressant, l'augmentation était plus élevée pour les transcrits de gènes impliqués dans l'oxydation du NH3 en NO2− (amo et hao) que ceux impliqués dans l'oxydation du NO2− (nxr) (Fig. 6b), ce qui suggère la possibilité qu'une partie du comammox ne serve que d'oxydants partiels plutôt que complets d'ammoniac dans des conditions acidifiées. Cependant, des investigations complémentaires sont encore nécessaires pour tester cette hypothèse. Ces données démontrent que l'acidification aquatique a un impact profond sur les communautés nitrifiantes et leur métabolisme physiologique dans les écosystèmes estuariens et côtiers.

En conclusion, nos résultats suggèrent que l'acidification aquatique en cours due aux effets synergiques de l'eutrophisation induite par l'activité humaine et du CO2 atmosphérique élevé pourrait perturber un lien vital du cycle de l'azote et augmenter la production du puissant gaz à effet de serre N2O dans les eaux estuariennes et côtières. Contrairement à nos attentes, une pCO2 élevée n'a pas montré d'effet de "fertilisation par le CO2" sur les nitrifiants chimioautotrophes dans des conditions acidifiées. Les nitrifiants répondent de manière significative à l'acidification au niveau de la transcription et régulent fortement à la hausse les expressions géniques associées à l'homéostasie du pH intracellulaire pour faire face au stress d'acidification. Ces résultats fournissent des informations importantes sur le mécanisme sous-jacent de l'acidification affectant la nitrification et les émissions de N2O associées, et nous proposons qu'une acidification supplémentaire dans les eaux estuariennes et côtières peut modifier le cycle de l'azote et accélérer le réchauffement climatique en stimulant les émissions de N2O.

Le fleuve Yangtze est le plus grand fleuve du continent euro-asiatique en raison de son débit d'eau et est également le troisième plus long fleuve du monde. Le bassin du fleuve Yangtze se caractérise par un développement économique rapide et une forte densité de population. En raison des activités humaines intensives, une quantité importante de N réactif a été déversée dans l'estuaire du Yangtze et la zone côtière adjacente, entraînant une grave pollution par l'azote et une acidification rapide de l'eau65. Par conséquent, l'estuaire du Yangtze a été choisi comme zone d'étude pour étudier les réponses du taux de nitrification et des émissions de N2O associées à l'acidification aquatique. Pour atteindre cet objectif, six sites d'échantillonnage représentatifs (Yz1 à Yz6) ont été sélectionnés le long du gradient estuarien depuis l'embouchure de l'estuaire jusqu'à sa zone côtière adjacente.

Dans cette étude, les eaux proches du fond, qui présentent généralement une nitrification plus active et une acidification plus sévère65,66, ont été collectées sur ces sites lors de la croisière de mars de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine en 2020, à l'aide de bouteilles Niskin-X montées sur un profileur conductivité-température-profondeur (CTD) (Sea-Bird 911 plus) (Fig. 1). La profondeur de l'eau, la salinité, le pH et l'OD ont été enregistrés avec un profileur CTD, un pH-mètre (Thermo Orion 3-Star) et la méthode de Winkler. Une partie de l'eau de chaque site a été conservée dans l'obscurité à 4 °C pour des expériences d'acidification ultérieures. Pendant ce temps, des quantités connues de sous-échantillons ont été immédiatement filtrées avec des filtres stériles à pores de 0, 22 μm (Waterman), et les filtrats ont été conservés pour des analyses de nutriments tandis que les membranes ont été soigneusement conservées à -20 ° C pour une extraction ultérieure de l'ADN (Méthodes supplémentaires). Une quantité supplémentaire de sous-échantillon du site Yz3 a également été conservée à 4 ° C dans l'obscurité pour des expériences de manipulation ultérieures à long terme.

Les expériences d'acidification ont été menées dans une série de systèmes de manipulation à flux continu (construits sur la base de bioréacteurs, Infors, Suisse, avec des échantillons d'eau de 4,0 L et un espace de tête de 1,0 L) en faisant barboter en continu et doucement des échantillons d'eau avec de l'air synthétique humidifié et filtré à 0,22 μm (79 % N2 et 21 % O2) : mélanges de CO2 (20 mL min-1, contrôlés avec précision par un débitmètre massique). Les bulles d'air d'admission:CO2 ont été doucement dispersées dans la masse d'eau par deux agitateurs qui ont été installés au fond et au-dessus du flux d'air d'admission (~ 30 tr/min), pour rendre le système d'eau homogène et pour équilibrer les phases liquide et gazeuse. Après l'équilibre, le gaz de l'espace de tête a été collecté à partir des réacteurs à l'aide de seringues étanches aux gaz pour des analyses des signatures isotopiques naturelles de N2O afin de révéler les voies de production de N2O (méthodes supplémentaires). Par la suite, les taux de nitrification ont été déterminés par l'ajout de 15NH4Cl (> 98 % atomique de 15N, inférieur à 20 % de la concentration ambiante) comme traceur et l'accumulation de 15N dans les pools de NOx− (NO3− + NO2−). Pendant les mesures de vitesse, le pH de l'eau a été maintenu stable via une solution de NaOH 0,2 M via le régulateur automatique acide-base du réacteur, car des protons (H+) peuvent être libérés pendant le processus d'oxydation du NH3. Pendant ce temps, la concentration d'OD a été maintenue saturée et le pCO2 a été maintenu au niveau ciblé via un flux de gaz de 100 mL h-1, et le gaz sortant a été collecté avec des sacs d'échantillonnage de gaz (Teflon®FEP, DuPont). La température a été maintenue à température ambiante (25 ° C) par une plaque chauffante automatique et un bain d'eau froide à circulation. Pendant l'incubation, le pH, l'OD et la température ont été enregistrés en temps réel via le capteur de pH équipé (Hamilton, Suisse), le capteur d'OD (Hamilton, Suisse) et le capteur de température (Infors, Suisse), respectivement. Les incubations ont été réalisées dans l'obscurité en recouvrant les cuves du réacteur avec du papier opaque. Des échantillons liquides (30 ml) ont été prélevés au début et à la fin de l'incubation de 24 h, avec des seringues étanches au gaz à travers un tube d'échantillonnage réservé (serré fermement après l'échantillonnage) et filtrés immédiatement (0,22 μm, Waterman). Une partie de l'eau filtrée a été utilisée pour les mesures de NO3− et NO2−, tandis que l'autre partie a été préparée pour l'analyse de 15NOx− en utilisant la "méthode dénitrifiante"67. De plus, d'autres échantillons d'eau de 30 ml ont été prélevés pour les mesures de DIC, d'alcalinité et de pCO2. Pendant ce temps, des échantillons de gaz ont été extraits à l'aide de seringues étanches aux gaz pour les mesures des isotopes de CO2, N2O et N2O. Avant utilisation, les solutions de réactifs ont été stérilisées par filtration (0,22 μm, Waterman), et le réservoir du réacteur et les matériaux associés ont été stérilisés à la chaleur (121 ° C et 15 psi pendant 20 min) (comme ci-dessous). Toutes les expériences ont été menées en triple. Les taux de nitrification ont été calculés à l'aide de l'équation suivante68 :

où Rnitrification est le taux de nitrification (nmol L−1 h−1), \({R}_{t0}{{{NO}}_{X}}^{-}\)et \({R}_{t}{{{NO}}_{X}}^{-}\) sont les rapports de 15N dans le \({{{NO}}_{X}}^{-}\) mesurés aux temps initial (t0) et final (t) de l'incubation , respectivement. \({\left[{{{NO}}_{X}}^{-}\right]}_{t0}\) et \({\left[{{{NO}}_{X}}^{-}\right]}_{t}\) sont les concentrations de \({{{NO}}_{X}}^{-}\) aux temps initial (t0) et final (t) de l'incubation, respectivement. \({\left[{\!\,}^{14}{{{NH}}_{4}}^{+}\right]}\) et \([{\,\!}^{15}{{{NH}}_{4}}^{+}]\) représentent la concentration ambiante de \({{{NH}}_{4}}^{+}\) et la finale \({\,\!}^{15}{{{NH}}_{4}}^{+} \) concentration après l'ajout du traceur isotope stable, respectivement.

Les taux de production de N2O ont été calculés sur la base de l'augmentation de la masse de 45 et 46 N2O (\({\,\!}^{45}N_{2}\) et \({\,\!}^{46}N_{2}\)) au cours des expériences69 :

où \({R}_{{N}_{2}O}\) est le taux de production de N2O (pmol N2O-N L−1 h−1). F est la fraction de 15N dans le pool de substrat (\({{{NH}}_{4}}^{+}\)), comme décrit ci-dessus. \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t0}\) et \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t}\) indiquent la quantité de \({\,\!}^{45}N_{2}O\) aux temps initial (t0) et final (t) de l'incubation, respectivement. \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t0}\) et \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t}\) sont la quantité de \({\,\!}^{46}N_{2}O\) aux temps initial (t0) et final (t) de l'incubation, respectivement. V représente le volume d'échantillon d'eau (L).

Pour distinguer les effets potentiels de l'augmentation du pCO2 et de la diminution du pH sur les taux de nitrification et la production de N2O associée sous acidification, une série de systèmes de manipulation à flux d'air continu a été construite de la même manière que dans les expériences d'acidification. En bref, quatre groupes de systèmes de simulation ont été construits : (a) 400 μatm/pH 8,1 (le groupe de contrôle ambiant), (b) 400 μatm/pH 7,8 (réduction du pH uniquement, maintien du pCO2 au niveau ambiant), (c) 800 μatm/pH 7,8 (le groupe d'acidification), (d) 800 μatm/pH 8,1 (augmentation de p CO2 uniquement, en maintenant le pH au niveau ambiant) (Fig. 7 supplémentaire). 4 L des échantillons d'eau prélevés sur le site Yz3 ont été ajoutés par réacteur, et 15NH4Cl (> 98 % atomique 15N) ont été ajoutés à moins de 20 % des concentrations ambiantes de NH4+. La chimie du carbonate a été manipulée en faisant barboter régulièrement les échantillons d'eau avec de l'air ajusté au CO2 filtré à 0,22 μm (400 μatm pour les groupes a et b, 800 μatm pour les groupes c et d) tout en ajustant le pH (7,8 pour les groupes b et c, 8,1 pour les groupes a et d) avec une solution stérile d'acide (HCl 0,1 M) ou de base (NaOH 0,2 M) via le régulateur automatique acide-base du réacteur. Les autres conditions de réaction (température, DO, débit de gaz, vitesse d'agitation et condition d'obscurité) étaient les mêmes que dans les expériences d'acidification. Les taux de nitrification et les taux de production de N2O ont été mesurés comme décrit ci-dessus pendant 24 h d'incubation après l'équilibre. Toutes les expériences ont été menées en triple.

Deux autres groupes de systèmes de manipulation ont été mis en place de manière similaire avec des échantillons d'eau du site Yz3 pour des expériences d'acidification à long terme : (a) 400 μatm/pH 8,1 (groupe témoin) et (b) 800 μatm/pH 7,8 (groupe d'acidification). Le pCO2 et le pH dans le plan d'eau ont été manipulés par barbotage continu avec de l'air ambiant humidifié et filtré à 0,22 μm (400 μatm, groupe a) ou de l'air enrichi en CO2 (800 μatm, groupe b), avec un pH stabilisé à 7,8 ou 8,1, respectivement. Au cours des expériences d'acidification à long terme, le NH4 + a été complété et maintenu à des concentrations proches de la température ambiante (inférieures à 10 μM) dans les réacteurs (Fig. 10 supplémentaire). Après qu'environ la moitié du NH4+ ait été consommée, des échantillons d'eau du site stérilisés par filtre avec des concentrations appropriées de NH4+ ont été utilisés comme milieu de culture et fournis à un débit de 1 L jour-1 à tous les réacteurs. Une solution de NaOH stérilisée de 0,2 M a été utilisée pour neutraliser le H+ libéré dans le processus de nitrification. L'OD a été maintenu saturé et la température a été maintenue à 25°C comme décrit ci-dessus. Pendant l'incubation, des échantillons liquides (10 ml) ont été prélevés des réacteurs chaque jour et immédiatement filtrés (0,22 μm, Waterman) pour les mesures de NH4+, NO3- et NO2-. 2 ml du gaz de l'espace de tête ont également été collectés chaque jour à l'aide de seringues étanches aux gaz pour les analyses de N2O et de CO2. Une quantité connue d'échantillon a été recueillie tous les plusieurs jours et culottée par centrifugation (20 000 g, 5 min). Les pastilles ont été immédiatement utilisées pour l'extraction de l'ADN et les analyses ultérieures de pyroséquençage et de qPCR (méthodes supplémentaires, tableau supplémentaire 10). Des sous-échantillons ont également été prélevés chaque semaine pour mesurer les taux de nitrification et de production de N2O. Au bout d'un mois d'incubation, les échantillons ont été récoltés, culottés (20 000 g pendant 5 min, sous 2 ° C) et cryoconservés immédiatement dans de l'azote liquide pour des analyses métatranscriptomiques ultérieures.

Pour l'enrichissement en AOA, un bioréacteur nitrifiant à flux continu (Infors, Suisse) d'un volume de travail de 4,0 L a été mis en place avec des échantillons d'eau douce du site Yz3. De l'eau de site stérilisée par filtre additionnée de NH4+ (~10 μM) et de streptomycine (~50 mg/L, pour inhiber les bactéries nitrifiantes70,71) a été fournie en continu à un débit de ~0,5 L jour-1. La concentration d'OD a été maintenue saturée en rinçant continuellement avec de l'air. Le pH a été maintenu à 8,1 avec une solution de KHCO3 0,2 M à travers le régulateur automatique acide-base du réacteur. Les incubations ont été conduites dans l'obscurité et la température a été maintenue à 25°C comme décrit ci-dessus. Pendant l'incubation, des échantillons liquides ont été prélevés du réacteur et filtrés immédiatement à l'aide de filtres de taille de pores de 0,22 μm (Waterman) pour la mesure de NH4+, NO3- et NO2-. De plus, des échantillons ont été prélevés (20 000 g, 5 min) pour l'extraction de l'ADN et le pyroséquençage ultérieur pour surveiller l'enrichissement en AOA (méthodes supplémentaires). Après 50 jours d'incubation, la culture d'enrichissement AOA a été récoltée pour mesurer les taux de nitrification et d'émission de N2O.

Les échantillons liquides prélevés dans les réacteurs ont été centrifugés (6 000 g, 5 min) pour récolter la biomasse enrichie en nitrification27. Ensuite, la biomasse précipitée au fond du tube de centrifugation a été lavée trois fois à l'aide d'eau de site stérilisée par filtre et remise en suspension dans celle-ci avant les mesures de vitesse. Par la suite, 100 μl de cette suspension ont été transférés dans des flacons en verre étanches aux gaz (120 ml) dans lesquels 10 ml d'eau de site fraîche stérilisée par filtre avec NH4+ (concentration finale d'environ 10 μM) ont été suffisamment barbotés avec de l'air ajusté au CO2 (400 μatm ou 800 μatm). Pendant l'incubation, le pH a été maintenu au niveau ciblé via l'ajout d'acide 3-(N-morpholino) propanesulfonique (MOPS, pH ajusté à 8,1 ou 7,8, concentration finale de 20 mM)23. Les flacons ont été incubés dans l'obscurité à 25 °C sur un agitateur orbital (30 tr/min). À chaque intervalle d'échantillonnage (0, 5, 8, 12 et 24 h), trois répétitions ont été sacrifiées et 2 ml du gaz de l'espace de tête ont été extraits pour les analyses de CO2 et N2O. Le pH et l'OD ciblés ont été confirmés à l'aide d'un pH-mètre Mettler-Toledo et d'un OXY Meter S/N 4164 avec un capteur à aiguille à oxygène (Unisense), respectivement. Pendant ce temps, 5 ml de suspension dans chaque flacon ont été immédiatement filtrés (0,22 μm, Waterman) pour les mesures de NOx-. Les taux de nitrification ont été estimés sur la base des changements linéaires des concentrations de NOx− avec le temps23. L'inhibition de l'activité de nitrification a été exprimée en pourcentage de réduction du taux de nitrification dans les traitements acidifiés par rapport au témoin ambiant. L'effet de l'acidification sur les émissions de N2O a été déterminé sur la base du pourcentage de variation de la concentration de N2O (dans l'espace de tête des flacons en verre) dans les traitements acidifiés par rapport au témoin ambiant23.

L'ARN total a été extrait des contrôles ambiants en triple (400 μatm/pH 8,1) et des traitements acidifiés (800 μatm/pH 7,8) à l'aide du kit EZNA® Soil RNA (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA) à la fin de l'incubation. L'ADN génomique résiduel a été retiré avec le kit sans ADN Turbo (Ambion) et vérifié par PCR à l'aide des amorces 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) et 909R (5′-CCCCGYCAATTCMTTT RAGT-3′) pour exclure la contamination par l'ADN23. La pureté, l'intégrité et la concentration de l'ARN extrait ont été mesurées à l'aide d'Agilent2100 (Agilent) et de Nanodrop2000 (Thermo). L'ARN ribosomal (ARNr) a ensuite été retiré via le kit de suppression d'ARNr Ribo-Zero (Epicentre) pour acquérir l'ARNm qualifié, qui a été utilisé pour les analyses qPCR (méthodes supplémentaires) et le séquençage du métatranscriptome.

Des bibliothèques d'ADNc métatranscriptomiques ont été construites avec le kit de préparation d'échantillons d'ARN TruSeq (Illumina) et séquencées sur une plate-forme Illumina HiSeq4000 après que des échantillons d'ARNm en triple des contrôles ambiants et les traitements acidifiés ont été regroupés individuellement72. La qualité des lectures brutes a été vérifiée via FastQC et ajustée par SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep). Par la suite, les lectures brutes ont été filtrées par qualité à l'aide de Sickle (https://github.com/najoshi/sickle), et les séquences avec des bases ambiguës (N), de faible qualité (inférieure à 20) et des longueurs inférieures à 50 paires de bases (pb) ont été rejetées. SortMeRNA (http://bioinfo.lifl.fr/RNA/sortmerna/) a ensuite été utilisé pour cribler et supprimer les lectures d'ARNr. Les lectures propres d'ARNm de haute qualité résultantes ont été assemblées à l'aide du pipeline d'assemblage Trinity de novo (les contigs de moins de 200 pb ont été supprimés)73. MetaGeneMark (http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi) a été utilisé pour prédire les cadres de lecture ouverts (ORF), et ceux de plus de 100 pb ont été traduits en séquences d'acides aminés. Les contigs non redondants (95 % d'identité ; 90 % de couverture) ont été obtenus via le logiciel CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/). Les niveaux d'expression des transcriptions ont été calculés via kallisto (https://pachterlab.github.io/kallisto/) et ont été rapportés en tant que TPM (Transcripts Per Kilobase Million). Le changement de pli (FC) dans l'expression relative des gènes a été calculé en comparant les traitements acidifiés au contrôle ambiant. Les affiliations taxonomiques des transcrits ont été attribuées par regroupement au meilleur résultat dans la base de données NR (BLASTP, valeur e ≤ 10−5). Les fonctions potentielles ont été attribuées en fonction de la meilleure homologie avec les protéines dans la base de données KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (BLASTP, valeur e ≤ 10−5). L'arbre de vraisemblance maximale a été construit avec IQ-TREE74 avec 1000 bootstraps ultrarapides, puis visualisé et annoté par iTOL (interactive tree of life)75.

Les concentrations de CO2 et de N2O ont été contrôlées par chromatographie en phase gazeuse (GC-2014, Shimadzu, Kyoto, Japon). Les rapports isotopiques de N2O (m/z = 44, 45, 46) ont été analysés par spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS, Delta V Advantage, Thermo Fisher Scientific, Brême, Allemagne). Les signatures isotopiques naturelles du N2O (δ15Nbulk, δ15Nα et δ18O) pour révéler les voies de production du N2O ont été analysées sur IRMS (Delta V Plus, Thermo Fisher Scientific, Brême, Allemagne). Les concentrations de NH4+, NO3− et NO2− ont été mesurées par colorimétrie à l'aide d'un analyseur de nutriments à flux continu (Skalar SANplus, Skalar Analytical BV, Breda, Pays-Bas) avec des limites de détection de 0,3 μM pour NH4+-N et 0,05 μM pour NO2−-N et NO3−-N. La concentration de DIC a été analysée par acidification et quantification ultérieure du CO2 libéré (Coulomètre de carbone, UIC-INC, Amérique). L'alcalinité et le pCO2 ont été calculés via le programme CO2SYS76, sur la base des mesures de pH et de DIC en utilisant les constantes de dissociation de l'acide carbonique de réf. 77 qui ont été réaménagés sous différentes formes fonctionnelles par la réf. 78.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS version 19.0 pour Windows (SPSS Inc., Chicago, I L. USA). Des différences significatives entre les groupes traités différemment ont été identifiées via une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test d'honnêteté de Tukey. Des courbes ajustées non linéaires (ajustement polynomial) ont été construites à l'aide d'Origin 2022b pour explorer les réponses de la nitrification et les taux de production de N2O associés à différents niveaux d'acidification. Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque P < 0,05.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données de séquence et les informations sur les échantillons sont disponibles dans la base de données SRA (Sequence Read Archive) du National Center for Biotechnology Information (NCBI) sous les numéros d'accès BioProject PRJNA876082. Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou les documents supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Nos. 41725002 [LJH], 41971105 [YLZ], 42222605 [YLZ], 42030411 [LJH], 42249903 [LJH], 41671463 [LJH] et 41730646 [ML]), les Chinois Programmes clés nationaux pour la recherche et le développement fondamentaux (n° 2016YFA0600904) [LJH], et fonds du directeur du laboratoire clé des sciences de l'information géographique (ministère de l'Éducation), East China Normal University (subvention n° KLGIS2022C03) [YLZ]. Des échantillons ont été prélevés lors des croisières de recherche ouvertes dans l'estuaire du Yangtze (NORC2020-03 et NORC2023-302). Nous remercions WS Gardner et Silvia E. Newell pour la discussion et la révision du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jie Zhou, Yanling Zheng.

State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Yangtze Delta Estuarine Wetland Ecosystem Observation and Research Station, East China Normal University, Shanghai, 200241, Chine

Jie Zhou, Yanling Zheng, Lijun Hou, Zhirui An, Feiyang Chen, Bolin Liu, Hongpo Dong, Xia Liang, Xiaofei Li et Dengzhou Gao

École des sciences géographiques, East China Normal University, Shanghai, 200241, Chine

Yanling Zheng, Li Wu, Lin Qi, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li et Min Liu

Key Laboratory of Geographic Information Science (Ministère de l'éducation), East China Normal University, Shanghai, 200241, Chine

Yanling Zheng, Li Wu, Lin Qi, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li et Min Liu

Key Laboratory of Spatial-temporal Big Data Analysis and Application of Natural Resources in Megacities, Ministry of Natural Resources, Shanghai, 200241, Chine

Yanling Zheng, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li et Min Liu

Université du Texas à Austin Marine Science Institute, Port Aransas, TX, 78373, États-Unis

Zhanfei Liu

Institut norvégien de recherche sur l'eau, Thormøhlensgt 53D, 5006, Bergen, Norvège

Richard Bellerby

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YLZ, LJH et ML ont conçu la recherche. JZ, YLZ, LJH, ZRA, FYC, BLL, LW et LQ ont effectué la recherche. JZ, YLZ, LJH, HPD, PH, GYY, XL, YY, XFL, DZG, YL, ZFL, RB et ML ont analysé les données. JZ, YLZ, LJH, RB et ML ont rédigé l'article.

Correspondance à Yanling Zheng, Lijun Hou ou Min Liu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Yong-guan Zhu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Zhou, J., Zheng, Y., Hou, L. et al. Effets de l'acidification sur la nitrification et les émissions d'oxyde nitreux associées dans les eaux estuariennes et côtières. Nat Commun 14, 1380 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

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Reçu : 16 septembre 2022

Accepté : 28 février 2023

Publié: 13 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

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