La modulation réciproque de la production d'ammoniac et de mélanine a des implications sur la virulence cryptococcique

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 849 (2023) Citer cet article

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Le champignon Cryptococcus neoformans est l'agent causal de la cryptococcose, une maladie qui est uniformément mortelle à moins d'être traitée avec des médicaments antifongiques, mais les schémas thérapeutiques actuels sont entravés par la toxicité de l'hôte et la résistance aux agents pathogènes. Une approche alternative attrayante pour lutter contre cette maladie mortelle est le ciblage direct des mécanismes de virulence dérivés des agents pathogènes. C. neoformans exprime de multiples facteurs de virulence qui ont été étudiés précédemment en tant qu'entités isolées. Parmi celles-ci, on trouve l'uréase, qui augmente le pH phagosomal et favorise l'invasion cérébrale, et la mélanisation, qui protège contre les cellules immunitaires et les traitements antifongiques. Nous rapportons ici une interdépendance réciproque entre ces deux facteurs de virulence. Les cellules hydrolysant l'urée libèrent du gaz ammoniac qui agit à distance pour augmenter le pH et augmenter les taux de mélanisation des cellules voisines, ce qui réduit à son tour la sécrétion de vésicules extracellulaires porteuses d'uréase. Cette relation réciproque se manifeste comme une propriété émergente qui peut expliquer pourquoi le ciblage de mécanismes de virulence isolés pour le développement de médicaments a été difficile et plaide pour une approche plus holistique qui considère le composite de virulence.

Les facteurs de virulence sont des traits qui confèrent aux microbes infectieux la capacité d'endommager et de persister chez les hôtes infectés malgré les réponses immunitaires1. Bien que les agents pathogènes aient tendance à utiliser plusieurs facteurs de virulence, y compris les revêtements de surface, les toxines et les enzymes, la plupart des études se concentrent sur la contribution indépendante à la pathogénicité d'un seul facteur sans tenir compte de sa contribution au composite de virulence2. Les mécanismes par lesquels les facteurs de virulence interagissent sont un sujet relativement inexploré dans la pathogenèse microbienne.

C. neoformans exprime une suite diversifiée de facteurs de virulence qui comprennent une capsule de polysaccharide, la production de mélanine et l'expression de diverses enzymes telles que l'uréase et la phospholipase, entre autres. La capsule de polysaccharide et le pigment de mélanine protègent contre la phagocytose et les explosions oxydatives des cellules phagocytaires, respectivement3,4. L'uréase est une enzyme nutritionnelle, qui interfère accidentellement avec l'acidification phagosomale en hydrolysant l'urée pour générer de l'ammoniac5 et joue un rôle crucial dans l'invasion cérébrale6,7, tandis que la phospholipase endommage les membranes phagosomales des macrophages et favorise la survie intracellulaire8. Il existe peu d'informations sur la manière dont ces facteurs de virulence interagissent les uns avec les autres.

Cette étude caractérise l'interaction entre l'activité de l'uréase cryptococcique et la mélanisation. L'uréase est libérée dans les vésicules extracellulaires et hydrolyse l'urée pour produire de l'ammoniac, qui est montré ici pour médier l'action à distance grâce à sa capacité à se déplacer sous forme de gaz. La réaction de mélanisation dépend du pH et est ainsi favorisée par une production accrue d'ammoniac par l'uréase. Il a été constaté que la mélanisation accrue favorisait la persistance des cellules cryptococciques dans les phagosomes et augmentait ainsi la dissémination cérébrale via un mécanisme de cheval de Troie. Le dépôt de mélanine dans la paroi cellulaire agit comme un mécanisme de rétroaction en réduisant la production de vésicules extracellulaires pour inhiber la libération d'uréase associée aux vésicules. Par conséquent, l'uréase et la mélanine présentent une modulation réciproque qui offre des avantages à différents stades de l'infection et cette coordination et cette synergie des facteurs de virulence entraînent des changements phénotypiques qui n'auraient pas pu être anticipés en étudiant chaque composant isolément.

Lors du dosage de l'activité uréase de C. neoformans dans un bouillon d'urée rapide9, nous avons remarqué qu'avec un temps d'incubation prolongé, le pH des milieux dans les puits sans cellules augmentait également (Fig. 1a, panneau de gauche). La mesure de l'absorbance à 560 nm (A560) pour chaque puits a révélé une relation linéaire directe entre le changement de couleur dans le puits sans cellule et le nombre de cellules dans le puits adjacent (Fig. 1a, panneau de droite). Pour déterminer si ce phénomène dépendait de l'activité de l'uréase, des cellules de type sauvage (WT) ou déficientes en uréase (ure1∆) ont été cultivées dans un bouillon d'urée dans un puits d'une plaque de 24 puits avec un milieu sans cellule dans les 23 puits restants. Après incubation à 30 ° C pendant 24 h, le milieu dans le puits contenant des cellules WT et plusieurs puits environnants a changé de couleur du jaune au rose alors qu'aucun changement de couleur n'a été observé pour la plaque contenant des cellules ure1∆ (Fig. 1b, panneau de gauche). La relation sigmoïde entre A560 du milieu acellulaire et la distance aux cellules WT produisant de l'ammoniac (Fig. 1b, panneau de droite) ressemblait à une courbe de titrage du pH pour laquelle le point médian est le pKa. Un ajustement de la courbe de Boltzmann des données donne une valeur médiane de 56 mm et suggère que le pH du milieu dans huit puits à cette distance a augmenté à au moins 7,9, le pKa du rouge de phénol dans le bouillon d'urée. À l'aide d'un détecteur de gaz d'ammoniac portatif avec une plage de 0 à 200 ppm, l'ammoniac était détectable pendant 30 s pour les cultures cultivées dans un bouillon d'urée pendant 24 h à 30 ˚C avec une densité cellulaire de départ minimale de 2 × 106 cellules/mL lorsque la concentration d'urée était maintenue constante à 2 % (Fig. 1c, panneau de gauche) ou avec une concentration minimale d'urée de 0,25 % et une densité cellulaire constante de 1 × 108 cellules/mL (Fig. 1c, panneau de droite). Dans les deux cas, la quantité cumulée d'ammoniac produite pendant 24 h était considérablement plus élevée, comme en témoigne l'augmentation du pH du milieu de culture à des densités cellulaires et des concentrations d'urée encore plus faibles (Fig. 1c).

a Photographies en couleur (panneau de gauche) de puits contenant du bouillon d'urée avec le nombre indiqué de cellules de C. neoformans ou aucune cellule après incubation à 30 ° C pendant 2 ou 6 h. L'absorbance à 560 nm (A560) du milieu sans cellule après 6 h montre une augmentation linéaire avec l'augmentation du nombre de cellules dans les puits adjacents (panneau de droite). b Plaques contenant du bouillon d'urée dans tous les puits et 1 × 108 cellules de type sauvage (WT) ou ure1∆ dans le puits supérieur gauche (A1) photographiées après 24 h à 30 ° C (panneau de gauche). Une relation sigmoïde entre A560 et la proximité du puits A1 (panneau de droite) est observée pour les cellules WT mais pas déficientes en uréase. c Pourcentage maximum A560 de surnageant de culture (rose) et de gaz ammoniac (NH3, noir) mesuré pour les cultures WT cultivées dans un bouillon d'urée à 30 ° C pendant 24 h avec une augmentation de la densité cellulaire de départ (panneau de gauche) ou une augmentation de la concentration d'urée (panneau de droite). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite exploré comment l'ammoniac libéré des cellules de C. neoformans aurait un impact sur les cellules voisines. Étant donné que l'oxydation chimique de la dopamine se produit plus facilement à un pH alcalin de 10, nous avons postulé qu'une augmentation du pH due à la production d'ammoniac pourrait favoriser la formation de mélanine. En effet, les cellules se développant sur de l'agar additionné de dopamine près de WT par rapport aux cellules ure1∆ dans un bouillon d'urée ont montré une plus grande production de pigment de mélanine qui a augmenté de manière linéaire avec la proximité de la source d'ammoniac (Fig. 2a). Comme C. neoformans se développe mieux à pH 11 acide, la mélanisation est systématiquement dosée dans un milieu minimal à pH 5,5. Lorsque le pH de l'agar additionné de dopamine a été titré de pH 5, 5 à 7, la production de pigment a augmenté de manière significative de pH 6 à 6, 5 et de pH 6, 5 à 7 (Fig. 2b). Cela suggère que l'augmentation de la mélanisation observée pour les cellules se développant à proximité des cellules productrices d'ammoniac était le résultat d'une augmentation du pH de la dopamine-agar. Alors que la production d'ammoniac par les cellules WT se développant dans un bouillon d'urée stimulait la mélanisation des cellules voisines se développant sur de la dopamine-agar à pH 5, 5, le pré-ajustement du milieu à pH 7 a donné des niveaux comparables de pigmentation pour WT, ure1∆ et plaques de contrôle sans cellules (Fig. 2c, panneau de gauche). Après 48 h à 30 ˚C, le pH de la dopamine-agar n'a augmenté de manière significative que dans la plaque contenant des cellules WT dans un bouillon d'urée, mais pas pour les plaques contenant ure1∆ ou des contrôles sans cellules (Fig. 2c, panneau de droite). Nous avons également examiné l'effet de la libération d'ammoniac sur la croissance de C. neoformans dans les puits voisins et avons constaté que le pH du milieu augmentait proportionnellement à la proximité croissante de la source d'ammoniac et que lorsque le pH augmentait à 8, 5 ou plus, la croissance était altérée (Fig. 2d).

a Cellules WT C. neoformans mélanisées pendant 24 h à 30 ° C sur gélose additionnée de 0, 1 (vert) ou 1 mM (orange) de dopamine (DA) en présence de cellules WT ou ure1∆ dans un bouillon d'urée (panneaux de gauche). La pigmentation quantifiée pour trois répétitions biologiques révèle une augmentation nette linéaire de la mélanisation avec une proximité croissante avec les cellules WT productrices d'ammoniac par rapport au mutant déficient en uréase (panneau de droite). b Les cellules WT mélanisées pendant 48 h à 30 ° C sur de l'agar additionné de DA 1 mM montrent une pigmentation significativement accrue à pH 6, 5 et 7, 0. n = 4, NS non significatif, ****p < 0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. c Pigmentation quantifiée (panneau de gauche) et pH de l'agar (panneau de droite) après croissance de WT C. neoformans à 30 ° C pendant 48 h sur de l'agar pH 5, 5 ou 7, 0 additionné de 1 mM DA adjacent à un puits contenant des cellules WT ou ure1∆ (mut) dans un bouillon d'urée ou un milieu sans cellule (nég). n = 4, NS non significatif, ****p < 0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. d Courbes de croissance des cellules se développant à la distance indiquée des cellules dans un bouillon d'urée. Le graphique représente la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. Le pH des surnageants de culture mesuré à la fin de l'expérience est indiqué. e Images représentatives (panneaux supérieurs) de cellules WT, lac1∆ ou lac2∆ cultivées sur de l'agar additionné de DA 1 mM près des cellules WT ou ure1∆ dans un bouillon d'urée. Le graphique représente l'augmentation nette de la pigmentation calculée en soustrayant les mesures pour chaque puits d'une plaque ure1∆ de celle du puits correspondant dans une plaque WT (panneau inférieur). n = 4, NS non significatif, ****p < 0,0001 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. f Images de fluorescence (GFP) et de fond clair (BF) (panneaux supérieurs) de cellules exprimant la GFP-laccase 1 après incubation à 30 °C pendant 24 h dans les colonnes 2 à 6 d'une plaque à 24 puits contenant des cellules WT dans un bouillon d'urée dans la colonne 1 (barre d'échelle = 5 µm). Le pH des surnageants de culture augmentait avec la proximité croissante des cellules produisant de l'ammoniac (panneau inférieur gauche, représenté par la moyenne ± écart type de 3 réplicats biologiques) et les niveaux de fluorescence GFP étaient significativement plus élevés dans les deux colonnes les plus proches de la source d'ammoniac (panneau inférieur droit). n = 3, NS non significatif, *p = 0,0154, **p = 0,0046 ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour déterminer si l'augmentation de la pigmentation produite en réponse à l'ammoniac était effectivement attribuable à la production de mélanine par C. neoformans ou simplement à une auto-polymérisation accrue de la dopamine qui est également accélérée par un pH alcalin de 10, nous avons étendu notre analyse pour inclure des souches mutantes défectueuses dans la production de mélanine. En réponse à la privation de glucose, C. neoformans exprime deux gènes de laccase, LAC1, le gène de laccase primaire, dont la suppression entraîne un phénotype albinos12, et l'homologue identique à 75 %, LAC2, qui est exprimé à un niveau inférieur et n'a qu'un défaut de mélanisation mineur lorsqu'il est supprimé13. Nous avons analysé la mélanisation des cellules WT, lac1∆ et lac2∆ sur de l'agar additionné de DA en présence de cellules WT ou ure1∆ dans un bouillon d'urée et avons constaté que la stimulation de la production de pigment médiée par l'ammoniac était supprimée pour lac1∆ mais pas pour lac2∆ (Fig. 2e). Ainsi, la laccase 1, principale laccase responsable de la mélanisation chez C. neoformans est également responsable des effets de mélanisation liés à l'ammoniac diffusible.

Étant donné que la mélanisation catalysée par la laccase 1 était spécifiquement stimulée par l'ammoniac produit par l'uréase, nous avons étudié l'impact du gaz ammoniac sur l'expression et la localisation cellulaire de la laccase 1. L'expression d'une protéine de fusion GFP-laccase 1 amino-terminale a révélé que l'enzyme est mal localisée dans les vésicules cytoplasmiques à pH acide et acheminée vers la paroi cellulaire à pH physiologique de 14. Nous avons cultivé la souche d'expression GFP-laccase 1 dans tous les puits d'une plaque de 24 puits, à l'exception de la première colonne verticale de puits, à laquelle des cellules WT dans un bouillon d'urée ont été ajoutées. Après incubation à 30 ˚C pendant 24 h, la localisation cellulaire de la GFP-laccase 1 a été visualisée par microscopie à fluorescence de cellules vivantes. Avec la proximité croissante de la source d'ammoniac diffusible, la GFP-laccase 1 est devenue de plus en plus ciblée sur la paroi cellulaire (Fig. 2f, panneaux supérieurs) et cela était corrélé à l'augmentation du pH du milieu de culture (Fig. 2f, panneau inférieur gauche). La mesure spectrophotométrique de la fluorescence GFP a révélé que les cellules des puits les plus proches de la source d'ammoniac avaient significativement plus de fluorescence que les cellules plus éloignées (Fig. 2f, panneau inférieur droit), ce qui est cohérent avec une plus grande expression de GFP-laccase 1 en réponse à l'augmentation de l'alcalinité du milieu de culture.

Alors que l'ammoniac produit par l'activité de l'uréase favorisait la mélanisation, la mélanisation à son tour diminuait considérablement l'activité de l'uréase (Fig. 3a). La mélanisation empêche l'absorption des liposomes dans les cellules15 et nous avons constaté que la paroi cellulaire mélanisée confère de la même manière une barrière à la libération de vésicules extracellulaires, comme en témoigne la fluorescence plus faible d'une sonde lipophile dans les surnageants de culture de cellules mélanisées par rapport aux cellules non mélanisées (Fig. 3b). Pour explorer plus directement l'impact de la mélanisation sur le transport vésiculaire, nous avons utilisé une méthode récemment optimisée pour l'isolement des vésicules extracellulaires à partir de cellules cultivées sur des supports solides16 afin de comparer les rendements des cellules non mélanisées et mélanisées. La teneur en lipides et l'activité de l'uréase étaient significativement plus faibles pour les préparations de vésicules provenant d'un nombre comparable de cellules WT cultivées sur de la gélose additionnée de dopamine 1 mM par rapport au milieu minimal seul (Fig. 3c). Pour la souche lac1∆ qui ne produit pas de pigment de mélanine, le rendement des vésicules extracellulaires et l'activité de l'uréase étaient comparables pour les cellules cultivées en l'absence ou en présence de dopamine (Fig. 3c). Ainsi, la mélanine dans la paroi cellulaire cryptococcique empêche le transport vésiculaire à partir des cellules, ce qui entraîne une baisse de l'activité de l'uréase car l'uréase est l'un des facteurs de virulence sécrétés dans les vésicules extracellulaires17. La diminution de l'activité uréasique des cellules mélanisées par rapport aux cellules non mélanisées s'est également manifestée par une diminution significative de la quantité d'ammoniac libéré (Fig. 3d) et de la capacité des cellules mélanisées à stimuler la mélanisation des cellules voisines (Fig. 3e).

a L'activité uréasique mesurée en tant que A560 des surnageants de culture de bouillon d'uréase au fil du temps était significativement plus élevée pour les cellules non mélanisées (NM) par rapport aux cellules mélanisées (MEL) (panneau de gauche ; n = 3, **p = 0,0045, ****p < 0,0001 ; ANOVA à deux voies avec le test de comparaisons multiples de Sidak) pour les cultures en triple avec des densités cellulaires statistiquement comparables (panneau de droite ; n = 3, NS non significatif ; non apparié ed, test t paramétrique bilatéral). b Diminution de la libération de vésicules extracellulaires de MEL par rapport aux cellules NM, mesurée par fluorescence de la sonde lipophile, 1, 6-diphényl-1, 3, 5-hexatriène (DPH), dans les surnageants de culture. n = 5, ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. c L'isolement de vésicules extracellulaires à partir d'un nombre comparable de cellules (panneau de gauche ; n = 3, NS non significatif) cultivées sur des plaques de milieu minimal (MM) ou de gélose additionnée de dopamine (DA) a donné une teneur en lipides significativement plus faible (panneau du milieu ; n = 3, NS non significatif, ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié) et une activité d'uréase (panneau de droite ; n = 3, NS non significatif, **p = 0 0,0074 ; test t paramétrique bilatéral non apparié) pour les cellules WT mais pas lac1∆ cultivées en présence de DA. d Plaques à 24 puits (à gauche) avec des cellules NM ou MEL dans un bouillon d'urée dans le puits A1 (en haut à gauche) et des milieux sensibles au pH dans les puits restants photographiés après incubation à 30 ° C pendant 24 h. Le diagramme de dispersion (à droite) de A560 pour les puits à moins de 50 mm (entourés de cercles) du puits A1 indique une production d'ammoniac considérablement réduite pour les cellules mélanisées. n = 7, ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. e Cellules WT cultivées pendant 18 h à 30 ° C sur de l'agar additionné de DA 1 mM dans des puits adjacents aux cellules NM ou MEL WT ou ure1∆ dans un bouillon d'urée (panneaux de gauche). Le graphique (à droite) de l'augmentation nette quantifiée de la pigmentation révèle une stimulation significativement plus grande de la mélanisation par NM par rapport aux cellules MEL WT. n = 4, ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour étudier l'impact de l'ammoniac produit par l'uréase pendant l'infection, des souris ont été inoculées avec environ 5 × 105 cellules WT ou ure1∆ par inhalation intranasale et l'infection a pu se poursuivre pendant 3 semaines. À ce moment, les animaux infectés par WT étaient nettement moribonds par rapport aux souris infectées par ure1∆, qui semblaient en bonne santé. La comparaison de la charge fongique dans les poumons a révélé une moyenne de 6, 1 × 108 unités formant colonies (UFC) pour WT, ce qui était plus d'un ordre de grandeur supérieur à la moyenne de 3, 1 × 107 mesurée pour ure1∆ (Fig. 4a). Pour deux des dix souris infectées par des cellules ure1∆, une infection pulmonaire productive ne s'est pas développée, de sorte que ces animaux ont été exclus d'une analyse plus approfondie. Les poumons disséqués de souris infectées par WT étaient significativement plus massifs que les poumons récupérés de souris infectées par ure1∆ (Fig. 4b). Conformément au rôle de l'activité de l'uréase dans la dissémination cérébrale6,7, la charge fongique cérébrale chez les souris infectées par voie intranasale avec ure1∆ était d'environ quatre logs inférieure à celle des poumons, alors que les UFC pour les souris infectées par WT n'étaient en moyenne qu'environ 100 fois plus faibles dans le cerveau par rapport aux poumons (Fig. 4a).

a Une infection intranasale a entraîné une charge fongique significativement plus élevée dans les poumons et le cerveau des souris infectées par WT (n = 10) par rapport à ure1∆ (n = 8, poumon ; n = 6, cerveau). ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. b La masse pulmonaire était également significativement plus élevée pour les souris infectées par voie intranasale avec WT par rapport à ure1∆. n = 10, WT ; n = 8, ure1∆, ****p < 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. c Niveaux d'ammoniac mesurés dans l'exhalant de souris infectées par WT ou ure1∆ enfermées dans une enceinte de 55 cm3 pendant 2 min. n = 7, ***p = 0,0001 ; test t paramétrique bilatéral non apparié. d Le pH du tissu pulmonaire mesuré à l'aide d'une électrode à aiguille MI-407 immédiatement après la dissection et après l'homogénéisation et la centrifugation du tissu était significativement plus élevé pour les souris infectées par WT par rapport à ure1∆ (n = 10, WT ; n = 8, ure1∆, **p = 0,0036 et *p = 0,0358, respectivement). e Images représentatives (panneaux supérieurs) de sections de tissu pulmonaire colorées par H & E de trois souris infectées par WT ou ure1∆ (flèches bleues ; barres d'échelle = 10 µm). Quantification du nombre total (panneau inférieur gauche ; n = 3, * p = 0,0316 ; test t paramétrique bilatéral non apparié) et du pourcentage (panneau inférieur droit ; n = 3, * p = 0,0274 ; test t paramétrique bilatéral non apparié) de cellules cryptococciques fortement mélanisées (flèches rouges) détectées dans des coupes de tissus de trois animaux infectés. f Images représentatives en champ clair de trois préparations indépendantes de particules riches en mélanine isolées des poumons de souris infectées par des cellules WT ou ure1∆ après ébullition de tissu homogénéisé dans de l'acide chlorhydrique concentré. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons postulé que C. neoformans uréase-positive produirait des niveaux détectables d'ammoniac au cours d'une infection pulmonaire aiguë. En enfermant les animaux infectés dans un petit récipient hermétique pendant 2 min, une lecture moyenne de 1, 1 ± 0, 5 ppm de gaz ammoniac a été mesurée dans l'haleine des animaux infectés par WT, par rapport aux souris infectées par ure1∆ pour lesquelles le gaz ammoniac était indétectable (Fig. 4c). À titre de comparaison, une lecture d'ammoniac comparable d'environ 1, 5 ppm a été mesurée pour 2 × 106 cellules de C. neoformans en croissance en présence de 2% d'urée (Fig. 1c). Nous avons prolongé notre enquête en mesurant le pH des poumons infectés après dissection en sondant le tissu avec une électrode de pH à aiguille. Ces mesures ont révélé un pH significativement plus élevé dans les poumons de WT par rapport aux souris ure1∆ (Fig. 4d), ce qui suggère que les animaux positifs à l'uréase produisent suffisamment d'ammoniac pour augmenter le pH des tissus infectés. Pour contrôler d'éventuelles variations régionales du pH dans tout l'organe, le tissu pulmonaire disséqué a été homogénéisé dans une solution saline stérile et le pH du surnageant acellulaire résultant a été mesuré à l'aide d'une électrode de pH standard. Conformément aux mesures in situ, le pH des homogénats de tissu pulmonaire était significativement plus élevé pour ceux dérivés de WT par rapport aux animaux infectés par ure1∆ (Fig. 4d). Nos résultats révèlent une conséquence imprévue de l'infection à C. neoformans, à savoir que l'activité de l'uréase libère de l'ammoniac gazeux qui modifie l'environnement cellulaire des tissus infectés en augmentant le pH.

Étant donné que la mélanisation était augmentée à des valeurs de pH plus élevées in vitro (Fig. 2), nous avons émis l'hypothèse que l'augmentation du pH pulmonaire dépendant de l'uréase favoriserait de la même manière la mélanisation in vivo. Malheureusement, les colorants à base d'argent ne distinguent pas de manière fiable les cellules mélanisées des cellules non mélanisées de C. neoformans, car les colorants réagissent également avec les polysaccharides de la paroi cellulaire18,19. Malgré cette limitation, il a été possible de discerner des cellules de C. neoformans profondément pigmentées du tissu environnant dans des coupes colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E) de Galleria mellonella20 infectée. De même, nous avons pu détecter un petit nombre de cellules fortement mélanisées dans des sections colorées H & E de tissu pulmonaire de souris infectées par WT ou ure1∆ (Fig. 4e, panneau supérieur). Comme les couches de mélanine se déposent progressivement dans la paroi cellulaire au fil du temps21, le nombre de cellules fortement pigmentées détectées est probablement une sous-estimation représentative du nombre total de cellules mélanisées. Un nombre significativement plus élevé de cellules mélanisées a été identifié dans des coupes colorées de tissu pulmonaire qui avaient été infectées par WT par rapport aux cellules ure1∆ (Fig. 4e, panneau inférieur gauche). Pour tenir compte de la différence de 10 fois dans les UFC pulmonaires pour les animaux infectés par WT et ure1∆, des zones de taille équivalente entourant chaque cellule mélanisée ont été quantifiées pour le nombre total de cellules cryptococciques. Cette analyse a révélé un pourcentage significativement plus élevé de cellules mélanisées pour WT par rapport à ure1∆ (Fig. 4e, panneau inférieur droit). La mélanine cryptococcique est stable aux acides22 et nous avons détecté des particules «fantômes» de mélanine résistantes aux acides caractéristiques après avoir fait bouillir des échantillons de tissu pulmonaire pendant 1 h dans de l'acide chlorhydrique concentré (Fig. 4f) qui étaient environ 3 fois plus abondantes pour WT par rapport à ure1∆. Le nombre accru de WT mélanisés par rapport aux cellules ure1∆ dans le tissu pulmonaire infecté est cohérent avec nos observations in vitro selon lesquelles la mélanisation était favorisée par la production d'ammoniac dépendante de l'uréase.

Comme la mélanisation augmente la survie de C. neoformans pendant la coincubation avec des macrophages4, nous avons cherché à étendre cette analyse en infectant des souris par voie intraveineuse avec des macrophages hébergeant des cellules de C. neoformans non mélanisées ou mélanisées. Nous avons mesuré des charges fongiques significativement plus élevées dans les poumons et le cerveau des animaux 24 h après l'infection avec des cellules mélanisées par rapport aux cellules non mélanisées (Fig. 5a). Cette observation soutient un modèle selon lequel les cellules mélanisées peuvent persister plus longtemps dans les phagolysosomes que les cellules non mélanisées. Nous avons également comparé les infections avec des macrophages portant des cellules ure1∆ non mélanisées et mélanisées et bien que les UFC soient comparables dans le tissu pulmonaire, il y avait un nombre significativement plus élevé de cellules mélanisées par rapport aux cellules non mélanisées dans le cerveau (Fig. 5b).

Charge fongique quantifiée dans les poumons et le cerveau de souris 24 h après une infection intraveineuse avec 2 × 105 macrophages porteurs de NM ou MEL WT ((a) n = 4, *p = 0,0167 et 0,0300 pour le poumon et le cerveau, respectivement ; test t paramétrique bilatéral non apparié) ou ure1∆ ((b) n = 5, NS non significatif, *p = 0,0414 pour cerveau ; test t paramétrique bilatéral non apparié). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

C. neoformans a développé de nombreuses propriétés protectrices qui favorisent la survie dans des habitats comme le sol et l'écorce des arbres où ceux-ci protègent contre les prédateurs amiboïdes23. Compte tenu des similitudes entre les amibes et les macrophages dans leur interaction avec ce champignon24, nombre d'entre eux fonctionnent également comme facteurs de virulence. Par exemple, la capsule de polysaccharide offre une protection contre la dessiccation dans l'environnement et permet aux cellules cryptococciques d'échapper aux attaques du système immunitaire de l'hôte25. Plusieurs autres facteurs sont sécrétés dans des vésicules extracellulaires appelées « sacs de virulence »17, dont l'uréase, qui hydrolyse l'urée pour produire de l'ammoniac26, et la laccase, qui catalyse l'oxydation des précurseurs phénoliques pour produire de la mélanine27. Les efforts pour traiter ou prévenir la cryptococcose se sont largement concentrés sur le ciblage de l'un de ces facteurs, par exemple, les vaccins basés sur les motifs de la fraction sucre glucuronoxylomannane (GXM) de la capsule28 ou les anticorps dirigés contre la mélanine29. Malgré des efforts concertés sur ces fronts30, un vaccin efficace n'a pas encore été développé et les schémas thérapeutiques antifongiques actuels ne sont pas totalement protecteurs31. Compte tenu de la nature multiforme de la virulence de C. neoformans, le développement de stratégies efficaces de traitement ou de prévention de la maladie peut bénéficier d'une approche combinatoire qui tient compte de l'interaction possible entre les facteurs de virulence individuels.

L'uréase est une enzyme largement exprimée dans les micro-organismes qui joue un rôle nutritionnel pour obtenir de l'azote à partir de l'urée, tout en jouant le rôle de facteur de virulence pour de nombreuses espèces de bactéries pathogènes, notamment Helicobacter pylori, Proteus mirabilis et Klebsiella pneumoniae32,33,34 et des champignons, tels que C. neoformans et Coccidioides posadasii26,35. La conversion de l'urée en ammoniac par ces microbes contribue à la pathogenèse en provoquant des lésions tissulaires et en tamponnant les environnements à faible pH36. Suffisamment d'ammoniac est produit par H. pylori pour que sa présence dans l'haleine humaine soit utilisée pour le diagnostic de l'infection37. Nous avons détecté une quantité faible mais mesurable de gaz ammoniac dans l'exhalant de souris portant une lourde charge fongique de cellules de C. neoformans uréase-positives dans leurs poumons, établissant une activité uréase lors d'une infection cryptococcique. L'ammoniac s'est avéré agir comme une molécule de signalisation capable de modifier la croissance et les résultats du développement de plusieurs espèces fongiques38,39,40. Ainsi, lorsque l'on considère les actions de l'uréase dans la virulence, il est également important de considérer les actions de son produit, qui peut diffuser à travers les tissus pour agir à distance pendant la pathogenèse. Nous avons découvert un rôle imprévu pour l'uréase au-delà de son rôle de modulation du pH dans les phagolysosomes5 car son produit volatil, l'ammoniac, augmente le pH à distance pour renforcer la mélanisation des cellules voisines. Le pH alcalin affecte la production de mélanine par un mécanisme à multiples facettes car il favorise les réactions chimiques nécessaires pour polymériser les précurseurs de la mélanine10, et augmente également l'expression et la localisation de la paroi cellulaire de la laccase 1, l'enzyme qui catalyse la réaction. Lorsque nous avons comparé le résultat de l'infection murine avec des macrophages porteurs de cellules mélanisées et non mélanisées de C. neoformans, nous avons constaté que la mélanisation augmentait l'invasion cérébrale, très probablement en prolongeant la survie des cellules cryptococciques dans les macrophages pour favoriser la transmigration par un mécanisme de cheval de Troie. Nos résultats révèlent comment un mécanisme de virulence opérant dans une cellule peut moduler à distance la virulence des cellules voisines, établissant un nouveau mécanisme de communication intracellulaire par les cellules microbiennes lors de l'infection.

Alors que l'uréase favorisait la mélanisation, les cellules mélanisées présentaient une libération réduite d'ammoniac médiée par l'uréase. La croissance de C. neoformans en présence de précurseurs de mélanine n'affecte pas l'expression de l'uréase41 mais le dépôt de mélanine sur la paroi cellulaire cryptococcique réduit la porosité de la paroi cellulaire42 et la perméabilité des cellules aux liposomes15. Nous avons constaté que la mélanisation empêche également la libération de vésicules extracellulaires à l'intérieur des cellules, et puisque l'uréase fait partie des facteurs de virulence transportés dans les vésicules, cela a diminué l'activité de l'uréase pour les cellules mélanisées. Étant donné que la croissance de C. neoformans est favorisée à faible pH11 et inhibée dans des conditions alcalines (Fig. 2d), la mélanisation réduit la libération de vésicules contenant de l'uréase, ce qui limite à son tour la production d'ammoniac pour maintenir le pH dans la plage optimale de croissance. Nous proposons un modèle dans lequel la relation inverse entre l'uréase et la mélanisation fournit un mécanisme de rétroaction qui fournit aux cellules fongiques un moyen d'ajuster rapidement l'activité de l'uréase en réponse aux conditions environnementales changeantes (Fig. 6).

La réplication de C. neoformans est favorisée à faible pH, mais à mesure que la densité de population augmente, la libération de gaz ammoniac médiée par l'uréase augmente également pour produire un environnement plus alcalin. La combinaison d'une mélanisation accrue et d'une réplication plus lente à un pH élevé prolonge la persistance des cellules cryptococciques dans les phagosomes pour augmenter la dissémination cérébrale via un mécanisme de cheval de Troie. Le dépôt de mélanine dans la paroi cellulaire fournit un mécanisme de rétroaction en empêchant la libération de vésicules extracellulaires porteuses d'uréase pour diminuer les niveaux d'ammoniac et restaurer le pH de croissance optimal. Des taux de croissance plus rapides devraient augmenter l'incidence de la libération lytique des phagocytes pour favoriser la traversée des cellules de levure libres à travers la barrière hémato-encéphalique.

L'interdépendance réciproque entre deux facteurs de virulence, l'activité uréasique et la mélanisation, constitue une propriété émergente dans la pathogenèse de C. neoformans servant à maximiser la survie fongique lors des variations temporelles et spatiales qui se produisent au cours de l'infection. Après inhalation, les cellules cryptococciques envahissantes sont englouties par les macrophages pulmonaires et cette rencontre a plusieurs issues possibles. La cellule hôte peut tuer la levure ou les cellules fongiques peuvent survivre et se répliquer dans la cellule hôte phagocytaire, entraînant une éventuelle exocytose lytique ou non lytique8. L'uréase joue un rôle central dans le résultat de cette interaction pathogène-hôte initiale, car la conversion de l'urée en ammoniac augmente le pH phagosomal et diminue les taux de croissance intracellulaire pour favoriser la persistance des cellules cryptococciques dans la cellule hôte. C. neoformans est inhabituel parmi les champignons pathogènes en ce qu'il manifeste un neurotropisme remarquable, de sorte que la plupart des cas de cryptococcose se présentent sous la forme d'une méningo-encéphalite. L'infection cérébrale disséminée nécessite le passage des cellules cryptococciques à travers la barrière hémato-encéphalique, soit sous forme de cellules de levure libres, soit transportées dans les macrophages par un mécanisme de «cheval de Troie»43. Alors que l'uréase joue un rôle vital dans la première voie6,7, elle peut être moins importante pour la dernière voie. Nos résultats suggèrent que la mélanisation, en prolongeant la survie dans les phagolysosomes, peut augmenter la fréquence à laquelle les cellules sont transportées dans le cerveau à l'intérieur des macrophages pour compenser la perte d'uréase, au moins partiellement.

En résumé, nous rapportons que deux facteurs de virulence majeurs de C. neoformans se modulent réciproquement de telle sorte que l'uréase produit de l'ammoniac volatil qui médie les effets sur les cellules voisines par une action à distance pour augmenter le pH et ainsi favoriser la mélanisation, qui à son tour réduit l'activité de l'uréase en inhibant la sécrétion de vésicules portant l'enzyme. La modulation réciproque de la production de mélanine et d'uréase produit à son tour des cellules fongiques avec différentes propriétés et résiliences qui peuvent favoriser la survie et la dissémination au cours des différentes phases de la cryptococcose. Pour les micro-organismes exprimant plusieurs facteurs de virulence, il est important de les étudier les uns dans les autres, car leurs effets combinés peuvent ne pas être prévisibles. En effet, la possibilité intrigante d'interactions supplémentaires entre les facteurs de virulence individuels chez C. neoformans justifie une enquête future. Par exemple, on peut également s'attendre à ce que l'uréase ait un impact sur la croissance de la capsule, car les cellules ont des capsules plus grandes lorsqu'elles sont cultivées à pH 7 par rapport à pH 544. La relation d'interdépendance décrite ici entre la production d'uréase et de mélanine lors d'une infection cryptococcique manifeste des propriétés émergentes qui ne sont ni prévisibles ni réductibles à leurs fonctions individuelles connues. La coordination entre les facteurs de virulence individuels pourrait contribuer à ce que la virulence soit une propriété émergente au niveau des interactions hôte-microbe45 et la reconnaissance de cette complexité devrait guider les futurs efforts de ciblage de la virulence microbienne.

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l'approbation préalable du Comité de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Johns Hopkins, sous le numéro de protocole approuvé MO21H124. La manipulation des souris et l'euthanasie avec du CO2 dans une chambre appropriée ont été menées conformément aux directives sur l'euthanasie de l'American Veterinary Medical Association. L'Université Johns Hopkins est accréditée par AAALAC International, conformément aux réglementations de la loi sur la protection des animaux et à la politique du service de santé publique (PHS) et dispose d'une assurance de bien-être animal approuvée par PHS auprès du Bureau du bien-être des animaux de laboratoire des NIH.

La souche KN99α de sérotype A de Cryptococcus neoformans de type sauvage et le mutant de délétion de la laccase 1, lac1∆, ont été obtenus à partir de la bibliothèque de gènes supprimés du Fungal Genetics Stock Center46. Le mutant de délétion laccase 2, lac2∆ (RPC 26) 13, a été obtenu auprès de Joseph Heitman et J. Andrew Alspaugh (Duke University, NC). Le mutant déficient en uréase, ure1∆26, et la souche GFP-laccase 114 ont été gracieusement fournis par John Perfect (Duke University, NC) et Peter Williamson (NIH, MD), respectivement.

WT ou ure1∆ Les cellules de Cryptococcus neoformans récupérées à partir de stocks congelés de glycérol à 50 % par croissance à 30 °C dans un milieu d'extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) ont été sous-cultivées dans un bouillon d'urée9 à la densité cellulaire spécifiée dans chaque légende de figure et transférées dans le puits indiqué d'une plaque de 24 puits. Après avoir chargé les puits restants avec du bouillon d'urée acellulaire, les plaques ont été scellées avec du parafilm et incubées à 30 °C pendant la durée indiquée. Le changement de couleur du milieu sans cellules du jaune au rose était une indication d'une augmentation du pH en raison de l'ammoniac qui diffusait à partir des cellules se développant dans un bouillon d'urée. Les plaques ont été photographiées à l'aide d'un appareil photo de 12 mégapixels et l'absorbance à 560 nm (A560) a été mesurée pour chaque puits sans cellule à l'aide du logiciel Softmax Pro 7.1 avec un lecteur de microplaques multimode SpectraMax iD5 (Molecular Dynamics). A560 d'un contrôle de bouillon d'urée a été soustrait de chaque lecture. Une méthode similaire a été utilisée pour comparer la diffusion d'ammoniac à partir de cellules non mélanisées et mélanisées, sauf que les cellules WT ont été pré-cultivées pendant 6 jours dans un milieu minimal (MM) composé de 29,4 mM de K2HPO4, 10 mM de MgSO4, 13 mM de glycine, 15 mM de D-glucose et 3 µM de thiamine à pH 5,5 ou MM additionné de 1 mM de chlorhydrate de dopamine (DA, M illiporeSigma H8502) avant d'être sous-cultivé à une densité de 5 × 107 cellules/mL dans un bouillon d'urée.

Les cellules WT ont été cultivées dans un bouillon d'urée à 30 ˚C pendant 24 h avec soit la même densité cellulaire de départ de 1 × 108 cellules/mL et une gamme de concentrations d'urée, soit avec une concentration d'urée constante de 2 % et une gamme de densités cellulaires de départ. Une culture témoin ure1∆ a été inoculée à une densité cellulaire de 1 × 108 cellules/mL dans un bouillon d'urée avec 2 % d'urée. Le capteur d'un détecteur de gaz ammoniac BT-5800G avec une plage de 0 à 200 ppm a été maintenu directement au-dessus d'un tube conique de 1,5 ml contenant 1 ml de chaque culture pendant 30 s et les lectures ont été enregistrées. Les mesures pour chaque culture WT ont été corrigées en soustrayant la mesure de fond faible du contrôle ure1∆, puis exprimées en pourcentage du maximum de 200 ppm. A560 des surnageants acellulaires recueillis par centrifugation à 2500 g pendant 5 min ont été mesurés, soustraits pour l'absorbance de fond du bouillon d'urée acellulaire et exprimés en pourcentage de la lecture maximale.

Le MM additionné de 0,1 ou 1 mM de DA et de gélose à 1,5 % a été distribué dans les puits indiqués d'une plaque à 48 puits et laissé se solidifier. Chaque puits d'agar additionné de DA a été repéré avec 5 × 105 cellules WT lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis WT ou ure1∆ ont été cultivées dans un bouillon d'urée à une densité cellulaire de 5 × 107 cellules/mL dans les puits A1-A6 de la même plaque de sorte que la mélanisation a été dosée à une distance de 13, 26, 39, 52, 65, 78 , soit 91 mm. Les plaques enveloppées de parafilm ont été incubées à 30 ° C pendant 24 h, puis photographiées à l'aide d'un appareil photo de 12 mégapixels. Les images ont été converties en images en niveaux de gris à l'aide d'Adobe Photoshop et l'intensité de la pigmentation de chaque tache a été quantifiée à l'aide du logiciel Image Studio Lite 5.2 (Li-Cor Biosciences). Pour dériver l'augmentation nette de la mélanisation conférée par la diffusion de l'ammoniac, les mesures de pigmentation pour chaque puits dans une plaque ure1∆ ont été soustraites de celle du puits correspondant dans une plaque WT. Une variante de ce test a été utilisée pour comparer la mélanisation par WT, lac1∆ et lac2∆ sur gélose additionnée de DA 1 mM adjacente à un puits contenant WT ou ure1∆ dans un bouillon d'urée comme décrit ci-dessus.

MM additionné de 1 mM de DA, 5 mM d'acide ascorbique (pour minimiser l'auto-polymérisation de DA qui se produit à pH élevé) et d'un système de tampon universel composé de 20 mM de Tris-HCl, de 20 mM de Bis-Tris et de 20 mM d'acétate de sodium, a été ajusté au pH souhaité, puis mélangé avec de la gélose à 1,5 % et distribué dans les puits d'une plaque à 4 puits. L'agar solidifié a été taché avec 5 × 105 cellules WT lavées au PBS et après incubation à 30 ° C pendant 48 h, les plaques ont été photographiées et la pigmentation a été quantifiée comme décrit précédemment. Une variante de ce test a été utilisée pour comparer la mélanisation sur DA-agar à pH 5,5 et 7,0 lorsqu'un bouillon d'urée contenait bien complété avec des cellules WT ou ure1∆ ou des milieux sans cellules. Le pH de la gélose dans chaque puits à la fin de l'expérience a été mesuré à l'aide de bandelettes indicatrices de pH ColorpHast.

Les cellules WT C. neoformans ont été sous-cultivées en triple à une densité de 1 × 105 cellules/mL dans un bouillon YPD 0,25X dans des puits d'une plaque à 48 puits à 13, 26, 39 ou 52 mm des puits contenant 5 × 107 cellules dans un bouillon d'urée. La plaque scellée au parafilm a été incubée à 30 ° C avec agitation orbitale continue dans un lecteur de plaque Spectromax iD5 et l'absorbance à 600 nm a été lue à des intervalles de 15 min sur une période de 36 h.

Une souche de C. neoformans exprimant la laccase 114 marquée GFP a été récupérée à partir d'un stock de glycérol à 50 % congelé par croissance à 30 °C dans un milieu d'extrait de levure-peptone-dextrose (YPD), puis sous-cultivée dans du MM additionné de 10 µM de CuSO4 pendant 3 jours à 30 °C. Les cellules ont été lavées dans du milieu frais puis distribuées dans les puits des colonnes 2 à 6 de trois plaques à 24 puits sur lesquelles 8 × 107 cellules WT dans un bouillon d'urée ont été placées dans chaque puits de la colonne 1, puis les plaques ont été scellées avec du parafilm. Après incubation à 30 °C pendant 24 h, des images en champ clair et en fluorescence GFP (longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 et 520 nm, respectivement) de cellules vivantes des colonnes 2 à 6 (à une distance de 19,3, 38,6, 57,9, 77,2 ou 96,5 mm des cellules produisant de l'ammoniac) ont été capturées à l'aide du logiciel QCapture-Pro 6.0 avec une caméra CCD numérique Retiga 1300 ( Teledyne Photometrics, Tucson, AZ) sur un microscope Olympus AX70 (Olympus, Center Valley, PA) en utilisant un microscope à objectif 100X à immersion dans l'huile. Les cellules des 4 puits de chaque colonne ont été regroupées et centrifugées pendant 5 min à 2500 g, puis le pH des surnageants de culture a été mesuré à l'aide d'un pH-mètre Accumet AB150 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 500 µL de milieu et la fluorescence a été quantifiée en utilisant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 485 et 535 nm, respectivement.

Les cellules WT C. neoformans cultivées à 30 ˚C pendant 4 jours dans du MM ou du MM additionné de 1 mM de DA ont été lavées avec du PBS, puis sous-cultivées en triple dans un bouillon d'urée à une densité de 1 × 108 cellules/mL dans des tubes de 14 mL bien bouchés. Après incubation à 30 ˚C pendant les durées indiquées, les échantillons de culture ont été filtrés à travers un filtre centrifuge Costar Spin-X 0,45 µm par centrifugation à 10 000 g pendant 2 min et A560 des filtrats acellulaires a été mesuré. La densité cellulaire de départ de chaque culture a été déterminée en étalant une dilution 10-6 de chacune sur de la gélose Sabouraud dextrose (SAB) et en comptant les unités formant colonies (UFC) après incubation à 30 ° C pendant 2 jours.

Les vésicules extracellulaires dans le surnageant des cultures de C. neoformans non mélanisées et mélanisées ont été quantifiées à l'aide de la sonde lipophile fluorescente, 1, 6-diphényl-1, 3, 5-hexatriène (DPH), comme décrit précédemment47. Cinq cultures biologiques répliquées ont été inoculées à une densité cellulaire de 1 × 108 cellules/mL dans du MM ou du MM additionné de 1 mM de DA et incubées pendant 24 h à 30 °C avant d'être sous-cultivées dans un milieu frais contenant 10 µg/mL de DPH. Après incubation pendant 24 heures supplémentaires à 30 ° C, les surnageants acellulaires ont été obtenus par deux centrifugations séquentielles à 2500 g pendant 5 minutes. La fluorescence a été quantifiée avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 360 ​​et 430 nm, respectivement, et les mesures brutes ont été corrigées en soustrayant la fluorescence de fond mesurée pour les milieux de contrôle sans cellule.

Des vésicules extracellulaires (VE) ont été isolées à partir de cellules de C. neoformans cultivées sur des milieux solides en utilisant un protocole décrit précédemment16 avec les modifications suivantes. Les cellules WT ou ∆lac1 récupérées à partir de stocks de glycérol à 50% congelés par croissance à 30 ° C pendant 24 h dans du milieu YPD ont été lavées avec du PBS, puis 1 × 107 cellules ont été étalées sur des plaques de milieu solide préparées en distribuant 20 mL d'un mélange 1: 1 de gélose à 3% et soit MM complété avec 10 µM d'urée ou MM complété avec 10 µM d'urée et 1 mM DA. Après incubation à 30 ° C pendant 48 h, les cellules ont été soigneusement récupérées de la surface de la gélose à l'aide d'une anse d'inoculation stérile. Les cellules de 2 plaques ont été mises en suspension dans un volume total de 3 mL de PBS stérile pour chacun des 3 réplicats pour chaque variable. Le nombre de cellules a été quantifié en comptant les dilutions de chaque échantillon à l'aide d'un hémocytomètre. Après centrifugation à 4 000 g pendant 15 min à TA, les surnageants ont été transférés dans de nouveaux tubes et centrifugés à 14 000 g pendant 15 min à TA. Après passage à travers un filtre de 0,8 µm, les surnageants acellulaires ont été centrifugés à 270 000 g pendant 1 h à 10 °C. Les pastilles EV ont été remises en suspension dans 100 ul de phosphate de sodium 10 mM, pH 7,0.

Les rendements relatifs en EV ont été comparés par quantification de la teneur en ergostérol à l'aide d'un kit de dosage du cholestérol Amplex RED (Invitrogen, A12216) en suivant le protocole fourni. En bref, 25 µL de chaque préparation EV ont été autorisés à réagir à 37 ° C pendant 30 min, puis la fluorescence a été quantifiée avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 550 et 590 nm, respectivement. Après avoir corrigé les mesures brutes en soustrayant la fluorescence de fond mesurée pour une réaction témoin sans cholestérol, la concentration d'ergostérol (µg/mL) a été extrapolée à partir d'une courbe standard de cholestérol.

L'activité uréase a été quantifiée pour 25 µL de chaque préparation EV par la méthode de Berthelot en utilisant un kit de dosage d'activité uréase (Sigma, MAK120) selon les instructions du fabricant. L'absorbance a été lue à 670 nm et l'activité de l'uréase (unités/L) a été calculée par extrapolation à partir d'une courbe standard d'ammoniac en utilisant l'équation, (échantillon A670 - blanc A670) × n / (pente × t) où n est le facteur de dilution et, t est le temps, et le blanc est le contrôle du test tampon uniquement.

Des études animales ont été réalisées sur des souris femelles C57BL/6 J (Mus musculus), âgées de 5 à 7 semaines (Jackson Laboratories) hébergées dans une installation avec une température ambiante cible de 22 ˚C et une plage acceptable de 19 à 25 ˚C, une humidité ambiante cible de 42 % et une plage acceptable de 30 à 70 %, et un cycle de lumière de 14,5 h/obscurité de 9,5 h. Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale d'un mélange de 50 mg/kg de kétamine et de 5 mg/kg de xylazine, puis infectées par voie intranasale avec ~ 5 × 105 cellules WT ou ure1∆ dans une solution saline stérile à 0,9 %. Les UFC pour chaque inoculum quantifiés en étalant des dilutions en série sur de la gélose SAB additionnée de 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) étaient de 5,8 × 105 et 6,3 × 105 pour WT et ure1∆, respectivement. Le sexe des animaux modèles a été choisi pour la conformité aux protocoles établis pour les infections à C. neoformans5,26 et n'est pas considéré comme influençant le résultat des expériences.

La pointe conique d'un tube à centrifuger de 50 ml (Fisher Scientific, 06-443-19) a été retirée et le capteur d'un détecteur de gaz ammoniac BT-5800G a été ajusté fermement dans le tube. Sous anesthésie à la kétamine / xylazine (comme décrit ci-dessus), les animaux infectés par WT ou ure1∆ pendant 20 à 22 jours ont été placés à l'intérieur du tube avec le bouchon bien fermé et les lectures sur le compteur de gaz ont été enregistrées après 2 min.

Des souris infectées pendant 20 à 22 jours par WT ou ure1∆ ont été euthanasiées par injection intrapéritonéale d'une dose létale de kétamine/xylazine (50 mg/kg pour les animaux infectés par WT déjà très malades à cause d'une charge fongique élevée dans les poumons ou 150 mg/kg pour les animaux infectés par ure1∆). Le tissu pulmonaire infecté a été exposé par dissection et sondé avec une électrode de pH à aiguille MI-407 (Microelectrodes Inc., NH) en combinaison avec un pH-mètre Accumet AB150 et une électrode de référence Ag/AgCl. Les poumons ont été pesés à l'aide d'une balance analytique DeltaRange (Mettler Toledo AT261). Les tissus pulmonaires et cérébraux homogénéisés dans une solution saline stérile à 0, 9% par passage à travers un tamis cellulaire de 100 µm ont été dilués en série et étalés sur de la gélose SAB + P / S pour quantifier les UFC dans chaque organe. Des échantillons de tissu pulmonaire homogénéisé ont également été centrifugés à 10 000 g pendant 5 min et le pH du surnageant résultant a été mesuré à l'aide d'un pH-mètre Accumet AB150.

Des échantillons de tissus pulmonaires disséqués de trois souris infectées par WT ou ure1∆ ont été fixés dans du formol à 10 % tamponné neutre à 4 ° C, puis soumis à une analyse histologique par les Johns Hopkins Oncology Tissue Services. Des sections minces (4 µm) coupées à partir d'échantillons inclus dans la paraffine ont été montées sur des lames Superfrost Plus. Après déparaffinage et rinçage avec du PBS, les coupes ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E), puis scannées.

Le tissu pulmonaire de souris a été homogénéisé dans 3 ml de solution saline à 0, 9%, mélangé avec un volume égal d'acide chlorhydrique concentré (12 N) et chauffé au bain-marie à 95 ° C pendant 1 h. Les échantillons refroidis ont été centrifugés à 10 000 g pendant 30 minutes et le matériau résistant aux acides a été remis en suspension dans 200 µL de PBS. Des montages humides ont été préparés en appliquant des échantillons de 8 µL sur des lames, examinés sous éclairage à fond clair à l'aide d'un microscope Olympus AX70 avec un objectif à immersion dans l'huile 100X, et les images ont été capturées à l'aide du logiciel QCapture-Pro 6.0 avec une caméra CCD numérique Retiga 1300. À partir de trois diapositives chacune, le nombre total de particules fantômes de mélanine identifiées était de 29 et 8 pour le tissu pulmonaire dérivé de souris infectées par WT et ure1∆, respectivement.

Des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) ont été extraits de souris C57BL/6 J et autorisés à se différencier comme décrit précédemment5. Les cellules ont été autorisées à se différencier dans un milieu BMDM composé de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % de pénicilline-streptomycine, 2 mM de GlutaMAX, 1 % de tampon HEPES, 0,1 % de 2-mercaptoéthanol et 20 % de surnageant conditionné de cellules L-929 dans des boîtes de culture non traitées de 100 mm ( Corning, 430591) pendant 6 à 7 jours à 37 ˚C dans 9,5 % de CO2. Les cellules différenciées ont été lavées avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et délogées des boîtes de culture par traitement avec Cellstripper pendant 10 min à 37 °C. Les cellules ont été lavées dans du milieu BMDM et ensemencées à une densité de 5 × 105 cellules par puits dans des plaques à 6 puits et incubées à 37 ° C dans 9, 5% de CO2 pendant 24 h. Les cellules WT ou ure1∆ C. neoformans cultivées pendant 3 jours à 30 ° C dans du MM (non mélanisé) ou du MM additionné de 1 mM de DA (mélanisé) ont été lavées dans un milieu BMDM à une densité cellulaire de 5 × 105 cellules / mL et opsonisées par incubation avec 2 µg / mL 18B7 mAb48 pendant 30 min à température ambiante. Le milieu de chaque puits de BMDM a été remplacé par un milieu contenant 1 × 106 cellules de C. neoformans et l'infection a pu se poursuivre pendant 1 h à 37 ° C. Les BMDM infectés ont été lavés 3 fois avec du HBSS pour éliminer les cellules de levure libres, puis lavés dans une solution saline stérile USP à 0,9 %. Des souris femelles C57BL/6 J, âgées de 5 à 7 semaines (Jackson Laboratories) ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale d'un mélange de 50 mg/kg de kétamine et de 5 mg/kg de xylazine et infectées avec des BMDM chargés de C. neoformans par injection rétro-orbitaire d'environ 2 × 105 cellules. Les UFC pour chaque inoculum ont été quantifiées en lysant les BMDM dans H2O stérile et en étalant des dilutions en série sur SAB + P/S agar. Après 24 h, les animaux infectés ont été euthanasiés par inhalation de CO2 et les poumons et les cerveaux disséqués ont été homogénéisés dans du PBS stérile par passage à travers un tamis cellulaire de 100 µm. Des dilutions en série de chaque homogénat tissulaire ont été étalées sur de la gélose SAB + P/S et les comptages d'UFC ont été corrigés pour les légères différences d'UFC de l'inoculum.

Les données ont été représentées graphiquement et analysées pour leur signification statistique à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9. Chaque point de données dans les diagrammes de dispersion indique une réplique biologique indépendante et les lignes horizontales indiquent la médiane. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de tests t paramétriques bilatéraux non appariés pour la comparaison de deux ensembles de données ou d'une analyse de variance unidirectionnelle ordinaire (ANOVA) avec le test de comparaisons multiples de Tukey pour l'analyse de plus de deux ensembles de données (ns = non significatif, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article. Les données sources sont fournies avec ce document.

Casadevall, A. & Pirofski, L.-A. Facteurs de virulence et leurs mécanismes d'action : le point de vue d'un cadre de réponse aux dommages. J. Water Health 7, S2–S18 (2009).

Article PubMed Google Scholar

McClelland, EE, Bernhardt, P. & Casadevall, A. Estimation des contributions relatives des facteurs de virulence pour les microbes pathogènes. Infecter. Immun. 74, 1500-1504 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozel, TR, Pfrommer, GST, Guerlain, AS, Highison, BA & Highison, GJ Rôle de la capsule dans la phagocytose de Cryptococcus neoformans. Rév. Infect. Dis. 10, S436–S439 (1988).

Article PubMed Google Scholar

Wang, Y., Aisen, P. & Casadevall, A. Cryptococcus neoformans mélanine et virulence : mécanisme d'action. Infecter. Immun. 63, 3131-3136 (1995).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fu, MS et al. L'uréase de Cryptococcus neoformans affecte le résultat de la pathogenèse intracellulaire en modulant le pH phagolysosomal. PLoS Pathog. 14, e1007144 (2018).

Article MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, M. et al. Imagerie en temps réel du piégeage et de la transmigration dépendante de l'uréase de Cryptococcus neoformans dans le cerveau de souris. J.Clin. Investir. 120, 1683–1693 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olszewski, MA et al. L'expression de l'uréase par Cryptococcus neoformans favorise la séquestration microvasculaire, améliorant ainsi l'invasion du système nerveux central. Suis. J. Pathol. 164, 1761-1771 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Léon-Rodriguez, CM et al. Le résultat de l'interaction cryptococcus neoformans-macrophage dépend de l'intégrité de la membrane phagolysosomale. J. Immunol. 201, 583–603 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Roberts, GD, Horstmeier, CD, Land, GA et Foxworth, JH Test rapide de bouillon d'urée pour les levures. J.Clin. Microbiol. 7, 584–588 (1978).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salomäki, M., Marttila, L., Kivelä, H., Ouvinen, T. & Lukkari, J. Effets du pH et des oxydants sur les premières étapes de la formation de polydopamine : une approche thermodynamique. J.Phys. Chim. B. 122, 6314–6327 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Levitz, SM, Harrison, TS, Tabuni, A. & Liu, X. La chloroquine induit les phagocytes mononucléaires humains à inhiber et à tuer Cryptococcus neoformans par un mécanisme indépendant de la privation de fer. J.Clin. Investir. 100, 1640–1646 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Salas, SD, Bennett, JE, Kwon-Chung, KJ, Perfect, JR & Williamson, PR Effet du gène laccase CNLAC1, sur la virulence du cryptococcus neoformans. J. Exp. Méd. 184, 377–386 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pukkila-Worley, R. et al. Réseau transcriptionnel de plusieurs gènes de capsule et de mélanine régis par la cascade d'AMP cyclique de Cryptococcus neoformans. Eucaryote. Cellule 4, 190-201 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waterman, SR et al. Ciblage de la paroi cellulaire de la laccase de Cryptococcus neoformans lors de l'infection de souris. Infecter. Immun. 75, 714-722 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Walker, L. et al. Les propriétés viscoélastiques de la paroi cellulaire fongique permettent le trafic d'ambisome sous forme de vésicules de liposomes intactes. MBio 9, e02383–17 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reis, FCG et al. Un nouveau protocole pour l'isolement des vésicules extracellulaires fongiques révèle la participation d'une scramblase putative dans l'exportation de polysaccharides et la construction de capsules chez Cryptococcus gattii. mSphere 4, e00080–19 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodrigues, ML et al. Les vésicules extracellulaires produites par Cryptococcus neoformans contiennent des composants protéiques associés à la virulence. Eucaryote. Cellule 7, 58–67 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kwon-Chung, KJ, Hill, WB & Bennett, JE Nouveau colorant spécial pour le diagnostic histopathologique de la cryptococcose. J.Clin. Microbiol. 13, 383–387 (1981).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, S. et al. La coloration à l'argent de Grocott à la méthénamine est l'approche optimale pour le diagnostic histologique de la cryptococcose pulmonaire. Devant. Microbiol. 13, 885511 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Eisenman, HC, Duong, R., Chan, H., Tsue, R. & McClelland, EE Virulence réduite des cryptococcus neoformans mélanisés chez Galleria mellonella. Virulence 5, 611–618 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Camacho, E. et al. L'unité structurelle de la mélanine dans la paroi cellulaire du pathogène fongique Cryptococcus neoformans. J. Biol. Chim. 294, 10471–10489 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y., Aisen, P. & Casadevall, A. Mélanine, «fantômes» de mélanine et composition de mélanine chez Cryptococcus neoformans. Infecter. Immun. 64, 2420-2424 (1996).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Casadevall, A., Fu, MS, Guimaraes, AJ & Albuquerque, P. L'hypothèse de la «virulence animale prédateur-fongique amiboïde». J. champignons (Bâle, Suisse) 5, 10 (2019).

CAS Google Scholar

Steenbergen, JN, Shuman, HA & Casadevall, A. Les interactions de Cryptococcus neoformans avec les amibes suggèrent une explication de sa virulence et de sa stratégie pathogène intracellulaire dans les macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 98, 15245–15250 (2001).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Decote-Ricardo, D. et al. Rôle immunomodulateur des polysaccharides capsulaires constituants de Cryptococcus neoformans. Devant. Méd. 6, 129 (2019).

Article Google Scholar

Cox, GM, Mukherjee, J., Cole, GT, Casadevall, A. & Perfect, JR Uréase en tant que facteur de virulence dans la cryptococcose expérimentale. Infecter. Immun. 68, 443–448 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williamson, PR Caractérisation biochimique et moléculaire de la diphénol oxydase de Cryptococcus neoformans : identification en tant que laccase. J. Bactériol. 176, 656–664 (1994).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guazzelli, L. et al. Un réseau de glycanes synthétiques contenant des fragments de polysaccharides capsulaires glucuronoxylomannanes de cryptococcus neoformans permet la cartographie des épitopes protecteurs. Chim. Sci. 11, 9209–9217 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosas, AL, Nosanchuk, JD & Casadevall, A. L'immunisation passive avec des anticorps monoclonaux se liant à la mélanine prolonge la survie des souris atteintes d'une infection mortelle à Cryptococcus neoformans. Infecter. Immun. 69, 3410–3412 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Datta, K. & Pirofski, L. Vers un vaccin contre le cryptococcus neoformans : principes et mises en garde. FEMS Yeast Res. 6, 525–536 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Iyer, KR, Revie, NM, Fu, C., Robbins, N. & Cowen, LE Stratégies de traitement de l'infection cryptococcique : défis, avancées et perspectives d'avenir. Nat. Rév. Microbiol. 19, 454–466 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eaton, KA, Brooks, CL, Morgan, DR & Krakowka, S. Rôle essentiel de l'uréase dans la pathogenèse de la gastrite induite par Helicobacter pylori chez les porcelets gnotobiotiques. Infecter. Immun. 59, 2470-2475 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, BD & Mobley, HL Proteus mirabilis uréase : organisation génétique, régulation et expression des gènes structuraux. J. Bactériol. 170, 3342–3349 (1988).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maroncle, N., Rich, C. & Forestier, C. Le rôle de l'uréase de Klebsiella pneumoniae dans la colonisation intestinale et la résistance au stress gastro-intestinal. Rés. Microbiol. 157, 184–193 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mirbod-Donovan, F. et al. L'uréase produite par coccidioides posadasii contribue à la virulence de ce pathogène respiratoire. Infecter. Immun. 74, 504-515 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rutherford, JC Le rôle émergent de l'uréase en tant que facteur général de virulence microbienne. PLoS Pathog. 10, e1004062 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kearney, DJ, Hubbard, T. & Putnam, D. Mesure de l'ammoniac respiratoire dans l'infection à Helicobacter pylori. Creuser. Dis. Sci. 47, 2523-2530 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Palková, Z. & Forstová, J. Les colonies de levure synchronisent leur croissance et leur développement.J. Cell Sci. 113, 1923-1928 (2000).

Article PubMed Google Scholar

Palková, Z. et al. L'ammoniac assure la communication entre les colonies de levures. Nature 390, 532-536 (1997).

Article ADS PubMed Google Scholar

Schindler, J. & Sussman, M. Ammonia détermine le choix des voies morphogénétiques chez dictyostelium discoideum. J. Mol. Biol. 116, 161–169 (1977).

Article CAS PubMed Google Scholar

Eisenman, HC, Chow, S.-K., Tsé, KK, McClelland, EE et Casadevall, A. L'effet de la L-DOPA sur la croissance et l'expression des gènes de cryptococcus neoformans. Virulence 2, 329–336 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Eisenman, HC et al. Microstructure de la mélanine associée à la paroi cellulaire dans le champignon pathogène humain Cryptococcus neoformans. Biochimie 44, 3683–3693 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, T.-B., Perlin, DS & Xue, C. Mécanismes moléculaires de la méningite cryptococcique. Virulence 3, 173-181 (2012).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Dykstra, MA, Friedman, L. & Murphy, JW Taille de capsule de cryptococcus neoformans : contrôle et relation avec la virulence. Infecter. Immun. 16, 129-135 (1977).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Casadevall, A., Fang, FC et Pirofski, L.-A. La virulence microbienne comme propriété émergente : conséquences et opportunités. PLoS Pathog. 7, e1002136 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, OW et al. Analyse génétique systématique de la virulence chez le pathogène fongique humain Cryptococcus neoformans. Cellule 135, 174-188 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rath, P. et al. Régulation génétique de la vésiculogenèse et de l'immunomodulation chez Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 110, E4790–7 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mukherjee, J., Casadevall, A. & Scharff, MD Caractérisation moléculaire des réponses humorales à l'infection à Cryptococcus neoformans et à l'immunisation par le conjugué glucuronoxylomannane-anatoxine tétanique. J. Exp. Méd. 177, 1105-1116 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Nous remercions les Johns Hopkins Oncology Tissue Services pour avoir fourni une imagerie histologique experte. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, numéro de subvention R01-HL059842 (AC).

Département de microbiologie moléculaire et d'immunologie, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, 21205, États-Unis

Rosanna P. Baker et Arturo Casadevall

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RPB et AC ont conçu le projet. RPB a développé une méthodologie, acquis et analysé des données et rédigé le manuscrit. AC a édité le manuscrit et obtenu des fonds.

Correspondance à Arturo Casadevall.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Agostinho Carvalho et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Baker, RP, Casadevall, A. La modulation réciproque de la production d'ammoniac et de mélanine a des implications pour la virulence cryptococcique. Nat Commun 14, 849 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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Reçu : 18 août 2022

Accepté : 07 février 2023

Publié: 15 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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